Información

19.3: Ensayos epigenómicos - Biología

19.3: Ensayos epigenómicos - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ChIP: un método para determinar dónde se unen las proteínas al ADN o dónde se modifican las histonas.

Dada la importancia de la información epigenómica en biología, se han realizado grandes esfuerzos para estudiar señales que cuantifiquen esta información. Los procedimientos de ChIP se describen a continuación y se muestran en la Figura 19.2:

  1. Las células se exponen a un agente de reticulación como el formaldehído, que hace que se formen enlaces covalentes entre el ADN y sus proteínas unidas (p. Ej., Histonas con modificaciones específicas).
  2. El ADN genómico se aísla del núcleo celular.
  3. El ADN aislado se corta mediante sonicación o enzimas.
  4. Los anticuerpos se cultivan para reconocer una proteína específica, como las implicadas en la modificación de histonas. Los anticuerpos se cultivan exponiendo las proteínas de interés para los mamíferos, como cabras o ratas, cuya respuesta inmune provoca entonces la producción de los anticuerpos deseados.
  5. Se añaden anticuerpos a la solución para inmunoprecipitar y purificar los complejos.
  6. La reticulación entre la proteína y el ADN se invierte y los fragmentos de ADN específicos de las marcas epigenéticas se purifican.

Después de un experimento de ChIP, tenemos secuencias cortas de ADN que corresponden a los lugares donde las histonas se unieron al ADN. Para identificar la ubicación de estos fragmentos de ADN en el genoma, se pueden hibridar con segmentos de ADN conocidos en una matriz o chip genético y visualizarlos con marcas fluorescentes; este método se conoce como chip-chip. Alternativamente, se puede hacer una secuenciación masiva paralela de la próxima generación de estos fragmentos; esto se conoce como ChIP-seq. El último enfoque, ChIP-seq, es un enfoque más nuevo que se usa con mucha más frecuencia. Se prefiere porque tiene un rango dinámico de detección más amplio y evita problemas como la hibridación cruzada en el chip ChIP.

Cada etiqueta de secuencia tiene una longitud de 30 pares de bases. Estas etiquetas se asignan a posiciones únicas en el genoma de referencia de 3 mil millones de bases. El número de lecturas depende de la profundidad de secuenciación, pero normalmente hay del orden de 10 millones de lecturas mapeadas para cada experimento de ChIP-seq.

Existe una canalización bastante estándar que se utiliza para inferir el enriquecimiento de la proteína de interés en cada sitio del genoma dado un conjunto de lecturas de secuenciación cortas de un experimento de ChIP-seq. Primero, los fragmentos de ADN deben mapearse en el ADN (lo que se denomina mapeo de lectura). A continuación, debemos determinar qué regiones del genoma tienen un enriquecimiento estadísticamente significativo de la proteína de interés (llamado pico de llamada). Después de estos pasos de preprocesamiento, podemos construir diferentes modelos supervisados ​​y no supervisados ​​para estudiar los estados de la cromatina y su relación con la función biológica. Analizamos cada uno de estos pasos uno a uno.

Secuenciación de bisulfito: un método para determinar dónde está metilado el ADN

La metilación del ADN fue la primera modificación epigenómica que se descubrió y es un regulador transcripcional importante en el sentido de que la metilación de residuos de citosina en dinucleótidos CpG da como resultado el "silenciamiento" o represión de la transcripción. La secuenciación de bisulfito es un método mediante el cual el ADN se trata con bisulfito antes de la secuenciación, lo que permite la determinación precisa de los nucleótidos en los que se ha metilado el ADN. El tratamiento con bisulfito convierte los residuos de citosina no metilada en uracilo, pero no afecta a las citosinas metiladas. Por lo tanto, el ADN genómico se puede secuenciar con o sin tratamiento con bisulfito, y las secuencias se pueden comparar, y los sitios en los que la citosina no se ha convertido en uracilo en el ADN tratado (o, de manera equivalente, los sitios en los que hay bisulfito) diferencia generada entre las secuencias tratadas y no tratadas) son sitios en los que se metila la citosina. Este análisis asume la conversión completa de residuos de citosina no metilados en uracilo, por lo que la conversión incompleta puede resultar en falsos positivos (es decir, nucleótidos identificados como metilados pero que de hecho no estaban metilados) [11].


Ver el vídeo: Introducción a la mutación genética. Khan Academy en Español (Diciembre 2022).