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¿Cuál es el tiempo de polimerización en gel SDS PAGE?

¿Cuál es el tiempo de polimerización en gel SDS PAGE?


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Estoy trabajando en la PÁGINA SDS del 20%. Quiero saber el tiempo de polimerización óptimo para un gel de resolución al 20% y un gel de apilamiento al 6%. Si aumento el tiempo, ¿afectaría el patrón de la banda?


Las concentraciones de APS y TEMED son muy importantes. Incluso con eso estandarizado, su poliacrilamida en el estante está perdiendo grupos reactivos mientras hablamos. ¿Quién sabe cuánto tiempo estuvo en el almacén? Todo se suma al hecho de que el tiempo mínimo requerido es prácticamente imposible de predecir.

Por otro lado, una vez polimerizado, un gel es estable durante días sin pérdida aparente de calidad. La polimerización durante la noche será "óptima" en el sentido de que el gel no mejorará con una polimerización más larga o más corta. Pero también lo será un gel de dos días. La gente solía lanzar geles todos los viernes y dejarlos en toallas de papel húmedas en la cámara fría durante la próxima semana.


No hay nada como un tiempo de polimerización general, ya que se trata de una reacción química que depende de muchos factores. Los mas importantes son:

APS: La concentración y la edad de la sustancia química son importantes. El APS se descompone con el tiempo cuando no se almacena completamente seco (lo que no ocurre en la mayoría de los bancos) y también con ciclos de congelación y descongelación durante el almacenamiento. APS proporciona los radicales libres necesarios para la reacción; sin él no se producirá ninguna polimerización. En mi experiencia, el APS es la parte más crítica de la reacción, ya que las viejas soluciones hacen que la polimerización sea realmente lenta. Haría una solución madre, la congelaría en alícuotas. Para hacer geles, descongelo en alícuotas y las guardo en la nevera durante una semana y luego las desecho.

TEMED: Es el catalizador de la reacción, demasiado de él iniciará la reacción muy rápido.

Temperatura: Cuanto más caliente esté, más rápida será la polimerización. En la cámara fría no obtendrá una reacción completa, si la hay.

Lo que puede hacer es almacenar la acrilamida restante en el vaso de precipitados y esperar hasta que se polimerice. Entonces su gel también debería estar bien para usar. Un tiempo de polimerización más largo (asumiendo que su gel se polimerizó completamente antes) no cambiará la capacidad de resolución de su gel.


Otros ya han explicado el efecto de diferentes factores sobre el tiempo de polimerización. Esta respuesta se trata principalmente de:

Si aumento el tiempo, ¿afectaría el patrón de la banda?

Puede.

Algunos consejos:

  • Haz un poco de mezcla extra para que puedas dejar un poco en el vaso para saber si ha ocurrido la polimerización.
  • Aplique siempre agua en el gel de resolución vertido para que el gel no se seque.
  • No deje el gel durante mucho tiempo después de la polimerización. No solo es una pérdida de tiempo, sino que también puede hacer que el gel se seque y que el SDS / urea precipite / cristalice.
  • Lave los geles con el tampón de funcionamiento después de retirar el peine / antes de cargar la muestra. Puede usar una aguja fina (calibre alto) para hacer eso.
  • Ejecute previamente el gel para equilibrarlo; esto generalmente no es necesario y, como dijo Nick Sandor, destruiría el gel de apilamiento. Sin embargo, es importante para geles de urea grandes y algo importante para geles SDS continuos si lo ha dejado durante bastante tiempo después de la polimerización. Por eso es mejor no dejar el gel durante mucho tiempo.

El tiempo de polimerización depende en gran medida de las concentraciones de APS y TEMED. No creo que el aumento del tiempo de polimerización influya de alguna manera en la división de las proteínas de manera negativa. En realidad el tiempo varía de 20 min a 1 h, pero yo personalmente dejo que el gel polimerice más tiempo. La acrilamida sin polimerizar podría formar aductos con algunas proteínas, lo que podría resultar en múltiples bandas. Además, la acrimamida en sí misma es tóxica, por lo que siempre le doy más tiempo para polimerizar. ¡Buena suerte!


ELECTROFORESIS | Técnicas de detección: tinción, autorradiografía y transferencia

Introducción

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una técnica altamente confiable y ampliamente utilizada para la separación, identificación y caracterización de proteínas y mezclas de proteínas. Aunque bidimensional (2D) -PAGE, que combina el enfoque isoeléctrico de proteínas (IEF) en la primera dimensión con el tamizado molecular de dodecilsulfato de sodio (SDS) -PAGE en la segunda dimensión, proporciona la resolución más alta que permite separar 1000-2000 individuos manchas polipeptídicas en un solo gel, 2D-PAGE es técnicamente muy exigente. Sin embargo, en la gran mayoría de aplicaciones, la PÁGINA unidimensional (1D), específicamente la PÁGINA SDS, proporciona una resolución suficiente y es especialmente adecuada para el análisis simultáneo de múltiples muestras de proteínas en un solo gel. Desde su introducción en 1951, se han realizado muy pocas modificaciones a los protocolos básicos para preparar y ejecutar geles 1D-PAGE, aunque se han introducido avances considerables para la detección y análisis de proteínas separadas por PAGE.

La tinción post-electroforética en gel es el método utilizado con más frecuencia para la detección de bandas o manchas de proteínas individuales en geles de 1D y 2D-PAGE, respectivamente, aunque se han descrito procedimientos para pre-tinción de proteínas antes de PAGE. La detección generalmente se realiza en el lugar dentro de la propia matriz de gel de poliacrilamida o después de la transferencia por electrotransferencia Western de proteínas desde geles PAGE a matrices de soporte de membrana polimérica. Los sistemas de detección incluyen protocolos de tinción basados ​​en tintes orgánicos y sales metálicas, etiquetado de grupos fluorescentes, interacciones proteína-ligando / receptor específicas, detección de actividad enzimática, así como tinciones específicas de grupos (por ejemplo, glico, fosfo, lipoproteínas, etc.) y detección inmunológica de complejos anticuerpo-antígeno. Alternativamente, las proteínas que se han marcado con moléculas radiactivas, ya sea antes o después de la electroforesis, pueden visualizarse usando detección autorradiográfica y fluorográfica en una película de rayos X. Aunque se ha descrito una plétora de protocolos de visualización y tinción de proteínas, ninguno es totalmente ideal y, a menudo, es necesario el uso de múltiples procedimientos de tinción y / o marcado de proteínas.


Cuando las proteínas se separan por electroforesis a través de una matriz de gel, las proteínas más pequeñas migran más rápido debido a la menor resistencia de la matriz de gel. Otras influencias sobre la velocidad de migración a través de la matriz del gel incluyen la estructura y la carga de las proteínas.

En SDS-PAGE, el uso de dodecil sulfato de sodio (SDS, también conocido como lauril sulfato de sodio) y gel de poliacrilamida elimina en gran medida la influencia de la estructura y la carga, y las proteínas se separan únicamente en función de la longitud de la cadena polipeptídica.

El SDS es un detergente con un fuerte efecto desnaturalizante de proteínas y se une a la estructura de la proteína en una proporción molar constante. En presencia de SDS y un agente reductor que escinde los enlaces disulfuro críticos para el plegamiento adecuado, las proteínas se despliegan en cadenas lineales con carga negativa proporcional a la longitud de la cadena polipeptídica.

La acrilamida polimerizada (poliacrilamida) forma una matriz en forma de malla adecuada para la separación de proteínas de tamaño típico. La fuerza del gel permite un fácil manejo. La electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas tratadas con SDS permite a los investigadores separar las proteínas en función de su longitud de una manera fácil, económica y relativamente precisa.


Preparación de gel separador

El volumen total entre las placas de nuestros cassettes de gel es de diez ml, por lo que si preparamos 10 ml de mezcla de gel separador por cassette tenemos más que suficiente. Por lo general, preparamos tres casetes por soporte y usamos el mejor de los tres. A partir de 30% de stock de acrilamida (ver notas a continuación) preparamos geles de composición de 7 a 15% de acrilamida, dependiendo del rango de proteínas que queramos separar. Nuestro stock de tampón de gel de separación (4x concentrado) consta de SDS al 0,4%, Tris-Cl 1,5 M, pH 8,8. Por casete, mezclamos 2,5 ml de solución amortiguadora y suficiente solución madre de acrilamida para que cuando la mezcla llegue al volumen final con agua destilada tengamos el porcentaje de monómero de acrilamida deseado.

La acrilamida se polimeriza espontáneamente en ausencia de oxígeno, por lo que el proceso de polimerización implica la eliminación completa del oxígeno de la solución. La polimerización es más uniforme si la mezcla se desgasifica para eliminar gran parte del oxígeno disuelto, colocándola al vacío durante aproximadamente 5 minutos antes de la polimerización. Iniciamos la polimerización agregando persulfato de amonio (AP) al 10% recién preparado a la mezcla seguido de N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED). Las cantidades de cada uno dependen de la calidad de la acrilamida utilizada y deben determinarse de antemano mediante prueba y error. Por lo general, comenzamos con 100 microlitros de AP y 10 microlitros de TEMED por cada 10 ml de mezcla de gel, y vemos cómo funciona. Una vez que se agregan los catalizadores, la polimerización puede ocurrir rápidamente, por lo que es necesario tener el soporte de fundición completamente listo y tener la solución de recubrimiento lista para usar (ver más abajo). Después de agitar para mezclar, simplemente vertimos la solución en el espacio ocupado por los casetes. Los casetes se autonivelarán eventualmente, pero la nivelación se puede acelerar agregando solución a los casetes seleccionados con una pipeta pasteur. El exceso de solución puede eliminarse inclinando el aparato y tirando del exceso con una pipeta, de modo que el nivel final esté en la marca de llenado.

Inmediatamente después de verter la mezcla de gel, debe cubrirse con butanol saturado de agua hasta una altura adicional de 0,5 cm aproximadamente (el butanol es la capa superior en el recipiente de reserva). Agregar butanol a un solo casete reducirá la mezcla de acrilamida, elevando el nivel en los demás, por lo que se debe tener cuidado de distribuir el butanol por igual entre los casetes. El propósito del butanol es producir una superficie lisa y completamente nivelada en la parte superior del gel separador, de modo que las bandas sean rectas y uniformes. El butanol retiene muy poca agua en solución, formando una capa limpia en la parte superior, razón por la cual lo usamos. El agua sería una superposición eficaz, pero se mezclaría con la solución de acrilamida, diluyéndola. De hecho, el butanol que utilizamos está saturado de agua para que no seque la mezcla de gel.

La polimerización se puede confirmar tirando un poco de la mezcla de gel restante en la pipeta, dejándola reposar y comprobando después de 10 minutos aproximadamente. Cuando la mezcla de gel ya no se puede expulsar apretando el bulbo, el gel separador se fija. No debe tomar más de 15 minutos para que se polimerice ninguna de las mezclas de gel. Si no se ha solidificado en ese momento, probablemente algo esté mal. A menudo, los "fabricantes de geles" por primera vez se engañan haciéndoles pensar que el gel no se ha polimerizado porque los 0,5 ml superiores o más de la mezcla de gel no se solidifican (algo de oxígeno llega a través de la superposición).


¿Qué podría hacer que el gel no se polimerice (solidifique)? - fabricación de gel (23 / Jun / 2008)

¿Me estoy perdiendo algo? ¿Alguno de los reactivos anteriores requiere almacenamiento a una temperatura particular antes de su uso? ¿Por qué mis geles no se solidifican como solían hacerlo?

Hola a todos. Mis geles para correr no se endurecen. He añadido

6 ml de acrilamida al 30% / bisacrilamida al 0,8%,
3,75 ml pH 8,8 Tris HCl 3 M,
100 uL 20% de SDS
5 ml de agua

¿Me estoy perdiendo algo? ¿Alguno de los reactivos anteriores requiere almacenamiento a una temperatura particular antes de su uso? ¿Por qué mis geles no se solidifican como solían hacerlo?

Lo intentaré y te responderé. Eres potencialmente mi contador de celdas de ahorro de día & # 33

Hola a todos. Mis geles para correr no se endurecen. He añadido

6 ml de acrilamida al 30% / bisacrilamida al 0,8%,
3,75 ml pH 8,8 Tris HCl 3 M,
100 uL 20% de SDS
5 ml de agua

¿Me estoy perdiendo algo? ¿Alguno de los reactivos anteriores requiere almacenamiento a una temperatura particular antes de su uso? ¿Por qué mis geles no se solidifican como solían hacerlo?

Cellcounter tiene razón. APS es el principal culpable. Es muy importante que guarde su APS seco en un desecador. Se irá mal con el tiempo si no lo haces (a mí me pasó a mí)
Clare

Ustedes tenían razón en el dinero. Tan pronto como rehice APS, usé APS nuevo y ¿qué sabes? Mi gel estaba duro como una roca (exagerado) en 30 minutos.

Ustedes tenían razón en el dinero. Tan pronto como rehice APS, usé APS nuevo y ¿qué sabes? Mi gel estaba duro como una roca (exagerado) en 30 minutos.

Hola a todos. Mis geles para correr no se endurecen. He añadido

6 ml de acrilamida al 30% / bisacrilamida al 0,8%,
3,75 ml pH 8,8 Tris HCl 3 M,
100 uL 20% de SDS
5 ml de agua

¿Me estoy perdiendo algo? ¿Alguno de los reactivos anteriores requiere almacenamiento a una temperatura particular antes de su uso? ¿Por qué mis geles no se solidifican como solían hacerlo?

He leído en alguna parte que mezclar demasiado la mezcla de gel puede causar saturación de oxígeno que luego impide la polimerización del gel. algo de verdad en eso?

Hola a todos. Mis geles para correr no se endurecen. He añadido

6 ml de acrilamida al 30% / bisacrilamida al 0,8%,
3,75 ml pH 8,8 Tris HCl 3 M,
100 uL 20% de SDS
5 ml de agua

¿Me estoy perdiendo algo? ¿Alguno de los reactivos anteriores requiere almacenamiento a una temperatura particular antes de su uso? ¿Por qué mis geles no se solidifican como solían hacerlo?

He leído en alguna parte que mezclar demasiado la mezcla de gel puede causar saturación de oxígeno que luego impide la polimerización del gel. algo de verdad en eso?

Eso es verdad. Pero a menos que lo mezcle como una nuez, eventualmente debería polimerizarse.

El oxígeno atmosférico es un eliminador de radicales libres que elimina los iones SO4 producidos por el APS inherentemente inestable necesario para la polimerización.

En los buenos tiempos, la gente también solía desairear la mezcla de acrilamida para polimerizar los geles.

Todavía estaba desaireando la mezcla de acrilamida para sacar el oxígeno de la solución el año pasado (por si acaso). Pero ahora descubrí que ya no es una necesidad. Todavía pueden polimerizar incluso sin desaireación & # 33


Separación y secuenciación de sacáridos de heparina y sulfato de heparán

1 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se crean mediante la polimerización de monómeros de acrilamida con el N, N-reticulante de metilenbisacrilamida. El tamaño de los poros, formado dentro del gel, depende de la cantidad de reticulación y de las longitudes de las cadenas de polímero. El persulfato de amonio se usa generalmente como iniciador de radicales libres mientras N, N, N & # x27, N & # x27-tetrametilendiamina (TEMED) estabiliza la reacción en cadena de polimerización. La reacción en cadena es inhibida por oxígeno molecular, por lo que la polimerización se lleva a cabo convencionalmente entre dos placas de vidrio delgadas con la parte superior de la solución de gel cubierta con butanol saturado en agua. Los geles utilizados para la secuenciación, etc. [como en la secuenciación integral de glucanos (IGS)] se ejecutan generalmente en un aparato de plataforma vertical.

Para el análisis de oligosacáridos derivados de heparina y heparán sulfato, se ha encontrado que un gel de poliacrilamida al 33% (con reticulante de acrilamida: bisacrilamida 19: 1) proporciona una buena separación. Sin embargo, la concentración de la solución de acrilamida se puede ajustar para dar tamaños de poro promedio más personalizados y, por lo tanto, rangos de separación. Se pueden utilizar geles de gradiente, pero son difíciles de moldear y la reproducibilidad plantea un problema grave. A diferencia de la electroforesis de proteínas, los geles de carbohidratos están en forma nativa y, por lo tanto, la conformación de carbohidratos (y por lo tanto la movilidad) dependerá de las estructuras de oligosacáridos exactas presentes en su interior. Por lo tanto, no se puede lograr una relación simple entre la distancia de migración directa y el tamaño.

Un método común para la visualización de oligosacáridos sin marcar es el colorante azul Azure A. La tinción se produce debido a interacciones iónicas con los grupos sulfato de carga muy negativa y ácido carboxílico presentes en esta clase de carbohidratos. Las manchas de fondo se pueden eliminar fácilmente lavando con agua bidestilada. El límite de detección es del orden de unos pocos microgramos (13). La detección de oligosacáridos separados en geles también se puede lograr usando radiomarcadores (19) o etiquetas fluorescentes (20) y también es posible la purificación a escala preparativa de sacáridos (21).


La historia de la electroforesis: pasado y presente

Las moléculas cargadas migran en un campo eléctrico. Este es el principio básico de la electroforesis, un método utilizado en casi todos los laboratorios de biología hoy en día y fundamental para la mayoría de las técnicas de separación y métodos analíticos.
Cuando escuchemos el término electroforesis probablemente pensaremos en electroforesis en gel, agarosa o acrilamida, especialmente SDS-PAGE & ndash, que es hoy en día el método electroforético más popular y más utilizado en la investigación en todo el mundo. Pero el campo de los métodos y aplicaciones electroforéticos es muy amplio y, a diferencia de las técnicas ahora dominantes, los primeros pasos de la electroforesis se realizaron en solución libre sin ningún tipo de medio de soporte.


Recursos de productos relacionados

Los geles prefabricados mPAGE® Bis-Tris proporcionan una excelente resolución de proteínas a un precio asequible. Al ofrecer una alta resolución de bandas de proteínas, los geles mPAGE® requieren tiempos de ejecución más cortos y son compatibles con grandes volúmenes de muestra, lo que hace que los geles prefabricados mPAGE® sean una herramienta valiosa para la investigación de proteínas.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo, asentamiento y mantenimiento de larvas de percebe

El percebe Amphibalanus anfitrito (previamente Anfitrito de Balanus) (Pitombo, 2004). El cultivo y el asentamiento de larvas de percebe se llevaron a cabo en el Laboratorio Marino de la Universidad de Duke en Beaufort, Carolina del Norte, siguiendo a Rittschof et al. (Rittschof y col., 1984a). Las larvas de percebe se asentaron en paneles de vidrio de 7,6 cm × 15,2 cm × 0,64 cm recubiertos con silicona (Dow Corning Silastic T2®, Midland, MI, EE. UU. O International Veridian®, Felling, Reino Unido) y se mantuvieron en el laboratorio como se describió anteriormente (Holm et al. al., 2005).

Microtomografía de rayos X

Se obtuvieron imágenes de percebes vivos utilizando microtomografía de rayos X (realizada en el Laboratorio de Investigación Naval en Washington, DC). El percebe mostrado en la Fig. 1A se había sedimentado y crecido en el centro de una placa Petri de poliestireno de 5 cm (Falcon nº 351006). El plato se utilizó para sujetar el percebe durante las exploraciones. Se eliminó el borde del plato a lo largo del camino de los rayos X para una mejor resolución. El percebe medía aproximadamente 10,5 mm × 9,3 mm a lo largo de sus ejes mayor y menor (paralelo y perpendicular al opérculo). El percebe no se sumergió en agua durante el escaneo. Todas las tomografías de rayos X se tomaron utilizando un sistema de tomografía Skyscan modelo 1172 con una cámara de 1,3 megapíxeles (Skyscan, Kontich, Bélgica). Las exploraciones se realizaron utilizando un ajuste de voltaje de fuente de rayos X de 80 kV con 0,45 grados. pasos de rotación (400 imágenes) y tomó aproximadamente 78 min. El tamaño del vóxel de la imagen fue de 10,4 µm.

La reconstrucción del haz de cono de la imagen se realizó utilizando el software propietario de Skyscan (NRECON www.skyscan.be/products/downloads.htm). Se aplicó la corrección de artefactos de anillo, pero solo se aplicaron correcciones mínimas de suavizado y endurecimiento del haz. Las imágenes reconstruidas se manipularon aún más para su visualización utilizando dos paquetes de software adicionales. ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) se utilizó para apilar y recortar regiones de interés, y para eliminar algunos artefactos de reconstrucción y renderizado. OsiriX (www.osirix-viewer.com) se utilizó para representaciones de isosuperficies tridimensionales. Las superficies enlucidas se hicieron aproximadamente un 25% transparentes para revelar las estructuras internas.

Cemento de percebe sin polimerizar

Para los estudios que utilizan cemento de percebe sin polimerizar, las gotas de cemento se obtuvieron a mano utilizando un método inspirado por Cheung y colegas (Cheung et al., 1977). La producción de cemento es continua durante la vida de un percebe (Saroyan et al., 1970), lo que hace posible la recolección de cemento no polimerizado. Los percebes se retiraron suavemente intactos de los sustratos de silicona usando una aguja de disección (Hamilton Bell, Montvale, Nueva Jersey, EE. UU.). Los percebes cuya placa base se rompió al retirarlos se desecharon. Después de la extracción, todas las placas de la carcasa (incluida la placa base) se limpiaron suavemente en agua desionizada con un hisopo de algodón. A continuación, los percebes se secaron con un Kimwipe® y se dejaron reposar al aire sobre una toalla de papel durante 3 h. Dejar que los percebes se sequen es fundamental para la formación de gotitas de cemento definidas. Para estimular la liberación de cemento, la periferia de la placa base, donde el cemento normalmente se libera durante el crecimiento (Fig. 1A: la unión de la placa base y las placas parietales), se pinchó suavemente en dirección hacia afuera con una aguja de disección. La apertura de los canales de cemento mediante la eliminación del cemento previamente polimerizado permite que se formen gotas de 1 a 2 μl, que pueden recogerse con una pipeta equipada con una micropunta. Al apretar muy suavemente el percebe entre el pulgar y el dedo (comprimiendo la placa base hacia el opérculo) aumentaba el volumen de cemento. Después de la recolección del cemento, los percebes no adheridos se mantuvieron en cuencos para dedos de vidrio de 10,5 cm que contenían 250 ml de agua de mar y se alimentaron diariamente con 10 ml de agua densa. Artemia sp. Los percebes se mantuvieron hasta por 2 meses. Para evitar una fuerte adhesión al recipiente de vidrio durante este tiempo, cada percebe se empujó suavemente (con un dedo) a una ubicación diferente en el recipiente todos los días. Los percebes se utilizaron en promedio una vez por semana para la recolección de cemento.

Concentración de proteína total

Se utilizó un ensayo de proteína de Coomassie (Bradford, 1976) para determinar la concentración de proteína total en cemento no polimerizado. Los ensayos de proteína total se llevaron a cabo usando Coomassie Protein Reagent (Pierce Chemical, nº 23200 Rockford, IL, EE. UU.). Se tomó una muestra de 0,5 μl de cemento sin polimerizar de cada percebe e inmediatamente se añadió a 15 μl de agua desionizada, se agitó en vórtex y se colocó en hielo. Cuando se recogieron todas las muestras, cada muestra se distribuyó en tres alícuotas de 5 μl en una placa de 96 pocillos que contenía 250 μl de reactivo de Coomassie. Se corrió una curva estándar BSA (0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 y 1000 μg ml –1) con las muestras de cemento. Las muestras se leyeron a 595 nm en un espectrofotómetro SpectraMAX® 190 de Molecular Devices (Sunnyvale, CA, EE. UU.). La proteína total se cuantificó para 54 percebes.

Electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

Inmediatamente después de la recolección del cemento, se añadió tampón de muestra reductor que contenía 10% (p / v) de SDS y 5% (v / v) de 2-mercaptoetanol (Laemmli, 1970) al cemento no polimerizado y las muestras se calentaron a 100 ° C durante 4 min. Se añadió un exceso de tampón de muestra reductor (80% del volumen total en lugar del 50%) para evitar la polimerización de las proteínas del cemento. Cada carril se cargó con 1-3μl de cemento sin polimerizar. Aunque el volumen de cemento varió entre geles dependiendo de la aplicación, todos los carriles dentro de un gel contenían el mismo volumen inicial de cemento sin polimerizar. Las muestras se procesaron en un gel de gradiente de 4-20% (Pierce Precise Precast Protein Gel, n. ° 25224, 12 carriles, 30 μl o no. 25244, 15 carriles, 25 μl) junto con marcadores de masa molecular (Novagen Trail Mix 10-225 kDa Protein Markers, nº 70980-3 EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE.UU.) a 40 V durante 15 min y luego a 100 V durante 1 h. Los geles que no se utilizaron para la transferencia Western se tiñeron durante la noche con azul de Coomassie [0,25% de azul brillante de Coomassie R-250 (grado de electroforesis BioRad, nº 161 0400) Hercules, CA, EE. UU.], Ácido acético al 7,5%, metanol al 5,0%). luego se destiñen en una solución de metanol al 25%, ácido acético al 7.5% durante 30 min y finalmente se destiñen en varios cambios de ácido acético al 7.5% durante 24 a 48 h.

Análisis de proteínas de cemento mediante espectrometría de masas en tándem

La espectrometría de masas en tándem sirvió para dos propósitos en este estudio: (1) se utilizó para validar nuestra técnica de recolección de cemento no polimerizado, al determinar si las proteínas de cemento de percebe secuenciadas previamente (que están disponibles en la base de datos del NCBI) podrían identificarse en nuestras muestras de cemento y ( 2) se utilizó para identificar las proteínas de la coagulación presentes en el cemento de percebe no polimerizado, comparando las secuencias de péptidos con las de un organismo en el que la coagulación ha sido bien estudiada: el ser humano. Los péptidos para el análisis se produjeron mediante digestión directa con tripsina de gotitas de cemento no separadas y digestión con tripsina de bandas aisladas de un gel SDS-PAGE. Las secuencias de péptidos se compararon con las de dos bases de datos no redundantes del NCBI: (1) percebe balanoide [para géneros inclusivos, véase Pitombo (Pitombo, 2004)] y (2) humano. La espectrometría de masas se llevó a cabo en la Instalación de Espectrometría de Masas de Proteínas de la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras.

En solución, la digestión con tripsina del cemento de percebe no polimerizado se realizó añadiendo 1 μl de cemento sin polimerizar directamente a 100 μl de bicarbonato de amonio de 40 mmol l –1 con acetonitrilo al 10% (grado de espectrometría de masas ACN). Se añadió inmediatamente a cada muestra tripsina de oro (1,3 μg de Promega nº V5280 Madison, WI, EE. UU. Reconstituido en 1 μg μl –1 en 50 mmol l –1 de ácido acético). Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 15 h, después de lo cual se añadió ACN al 50% del volumen total y las muestras se enviaron durante la noche a la Universidad de Puerto Rico para su análisis por espectrometría de masas.

Para la digestión en gel, se corrió cemento no polimerizado en SDS-PAGE en condiciones reductoras (gel de gradiente de 4-20% con 1 µl de cemento por carril) como se describe anteriormente. Los geles se tiñeron durante la noche (Coomassie Brilliant Blue R-250 al 0,25%, ácido acético al 7,5%, metanol al 5,0%). Se enviaron geles víaenvíelo durante la noche a la Universidad de Puerto Rico durante la tinción colocando cada gel en una bolsa de plástico sellada con ∼50 ml de tinción Coomassie Blue. Una vez en la Universidad de Puerto Rico, los geles se decoloraron en metanol al 40%.

Después de la decoloración inicial, las bandas de proteínas individuales detectadas mediante la tinción con azul de Coomassie se escindieron cuidadosamente del gel con un bisturí, se destiñeron con 100 mmol l -1 de bicarbonato de amonio: 50% ACN y luego se deshidrataron en 100% ACN. Después de la eliminación de ACN por velocidad-vacío, la rodaja de gel se rehidrató en 40 mmol l -1 de bicarbonato de amonio y 10% de ACN. Se añadió tripsina (1 mg) y se llevó a cabo la incubación durante la noche (18 h) a 37ºC. Los péptidos trípticos se eluyeron de la rodaja de gel incubando la rodaja en una solución que contenía 50% de ACN y 5% de ácido fórmico durante 1 ha temperatura ambiente.

Los péptidos trípticos se cargaron en un sistema de HPLC Surveyor® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Y los péptidos se eluyeron utilizando un gradiente de ACN (0% -80%) en ácido fórmico al 0,2% / H2O, directamente en la fuente de ionización de electropulverización. Los péptidos trípticos eluidos se infundieron en un espectrómetro de masas LTQ (Thermo Fisher Scientific) para el análisis de espectrometría de masas en tándem de las proteínas de interés.

Los espectros de masas en tándem se extrajeron mediante BioWorks® V. 3.2 (Thermo Fisher Scientific). No se realizaron la desconvolución y desisótopo del estado de carga. Todas las muestras de espectrometría de masas en tándem se analizaron utilizando Sequest® V. 2.7 (ThermoFinnigan, San José, CA, EE. UU.). La secuencia se estableció para buscar en las bases de datos de humanos y de percebes de Balanoid (sub-bases de datos no redundantes de NCBI) asumiendo que la enzima de digestión era tripsina. Se buscó en la secuencia con una tolerancia de masa de iones de fragmentos de 1,00 Da y una tolerancia de iones de origen de 2,0 Da. Solo los péptidos identificados que pasaron los filtros de selección impuestos en la búsqueda de la base de datos se tuvieron en cuenta para la identificación de proteínas (correlación cruzada superior a 1,5 (+1), 2,0 (+2) o 2,5 (+3) puntuación delta & gt0,1 10 o más iones byy intensidad MS2 de & gt5 × 10 –4, probabilidad de péptido & gtE × 10 –2). Además, se utilizó Scaffold® (V. Scaffold-01_07_00, Proteome Software Inc., Portland, OR, EE. UU.) Para validar las identificaciones de péptidos y proteínas basadas en espectrometría de masas en tándem. Se aceptaron las identificaciones de péptidos si podían establecerse con una probabilidad superior al 95,0% según lo especificado por el algoritmo de Peptide Prophet (Keller et al., 2002). Se aceptaron las identificaciones de proteínas si podían establecerse con una probabilidad superior al 99,0% y contenían al menos dos péptidos identificados. Las probabilidades de proteínas fueron asignadas por el algoritmo Protein Prophet (Nesvizhskii et al., 2003). Las proteínas que contenían péptidos similares y que no se podían diferenciar basándose únicamente en el análisis de espectrometría de masas en tándem se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia.

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

Se utilizaron imágenes AFM de cemento de percebe para validar nuestra técnica de recolección de cemento. El AFM se realizó en el Laboratorio de Investigación Naval en Washington, DC, utilizando un AFM Veeco Nanoman (Instrumentos digitales, Dimension 3100 Veeco, Santa Barbara, CA, EE. UU.) En modo de tapping. Todas las imágenes se realizaron en el aire. La obtención de imágenes en el aire es apropiada para el cemento de percebe. Si bien el cemento está hidratado, los niveles de hidratación en ambientes ambientales no son significativamente diferentes de aquellos en las interfaces nativas de percebe-pegamento (Barlow et al., 2009). Las imágenes se extrajeron utilizando WSxM V. 3.0 Beta 11.1 (Horcas et al., 2007).

Se fotografió el cemento primario (cemento original secretado por el percebe) en el lugar, directamente sobre la base de percebes. Los percebes se retiraron suavemente intactos de un sustrato de silicona usando una aguja de disección y se enjuagaron brevemente en agua desionizada. Las placas de concha se secaron usando un Kimwipe®. Para la obtención de imágenes, cada percebe se fijó a un portaobjetos de microscopio en una posición nivelada invertida utilizando masilla para esculpir.

Para AFM de cemento no polimerizado después del curado, se depositó 1 μl de cemento no polimerizado en un portaobjetos de microscopio de vidrio de 75 mm × 25 mm y se cubrió inmediatamente con un portaobjetos de vidrio de 10 mm × 30 mm × 1 mm (l × w × d) (cortado a medida) con un trazador de líneas de diamante, colocado con aproximadamente 5 mm colgando sobre el borde del portaobjetos de 75 mm × 25 mm para facilitar la extracción) y colocado en agua de mar para simular la interfaz percebe-cemento-sustrato. Después de 48 h, se sacó el portaobjetos del agua de mar, se retiró el portaobjetos de cobertura y la gota curada se lavó ligeramente en agua desionizada. Se obtuvieron imágenes de la gota curada en varias regiones.

Western blot para tripsina pancreática bovina

Después de SDS-PAGE (como se describió anteriormente), las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore Immobilon Psq, tamaño de poro de 0,2 µm, nº ISEQ 081 00 Billerica, MA, EE. UU.). Las proteínas se transfirieron a 4ºC a 15 V durante la noche usando tampón de transferencia Tris-glicina (pH 8,3) que contenía metanol al 15%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie después de la transferencia para evaluar la transferencia de proteínas.

Las proteínas del cemento de percebe que se habían transferido a las membranas de PVDF se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) para reducir la unión no específica y se inmunoteñieron con anticuerpos para la tripsina pancreática bovina. Se usó tampón TBS (pH 7,6) para toda la inmunotinción. Se usó anticuerpo policlonal de conejo contra tripsina pancreática bovina de longitud completa (dilución 1: 10.000) como anticuerpo primario (Novus Biologicals nº NB 600-1277 Littleton, CO, EE. UU.). El anticuerpo policlonal anti-conejo (dilución 1: 20.000), conjugado con peroxidasa de rábano picante, se utilizó como anticuerpo secundario (Novus Biologicals nº NB7160). Los anticuerpos se detectaron utilizando un sustrato TMB (Vector Laboratories nº SK4400 Burlingame, CA, EE. UU.). No se observó actividad de peroxidasa endógena en proteínas de transferencia Western. La tinción de control para la unión no específica se realizó solo con anticuerpo secundario. La tripsina pancreática bovina (tratada con TPCK, Sigma-Aldrich, nº T1426 St Louis, MO, EE.UU.) se sometió a transferencia Western junto con proteínas de cemento de percebe como control positivo.

Cuantificación de la actividad de la tripsina

BAPNA (norteα-benzoil-dl-arginina 4-nitroanilida Acros Organics no. 227740010 Geel, Belgium) was used as a trypsin substrate and prepared at 0.044% (w/v) by first dissolving BAPNA in DMSO (dimethyl sulfoxide: 1% v/v) and then adding 50 mmol l –1 Tris buffer,pH 8.0. Reaction conditions (pH, incubation temperature, buffer concentration)followed Dougherty (Dougherty,1996) who optimized reaction conditions for general protease activity in unpolymerized cement from the barnacle Chthamalus fragilis.

To assay trypsin activity, 6 μl unpolymerized cement was added to 800μl BAPNA solution. Samples were vortexed and incubated at 37°C for 1 h. Two controls were run along with cement samples: (1) substrate only – 6μl Tris buffer (50 mmol l –1 , pH 8.0) with 800 μl BAPNA solution, and (2) trypsin positive control – 6 μl trypsin solution(4.63E –3 BAPNA units ml –1 porcine pancreatic trypsin Type II-S, Sigma-Aldrich no. T7409, in Tris buffer) with 800 μl BAPNA solution. Control samples were vortexed and incubated at 37°C for 1 h along with cement samples. Following incubation, all samples were centrifuged at 6400 gramo for 10 min in a Fisher Scientific MicroD centrifuge. Samples were transferred to a quartz semi-micro cuvette (Starna Cells no. 9-Q-10 Atascadero, CA, USA) and optical density at 405 nm(OD405), referenced to Tris buffer alone, was read on a Hewlett Packard 8451A diode array spectrophotometer (Palo Alto, CA, USA). Samples were staggered in approximately eight sample groups (each with controls) so that all samples could be read within 10 min of centrifugation. Statistical analyses were conducted using SigmaStat® V. 3.10.0 (Systat Software Inc.,San Jose, CA, USA).

Verification of trypsin activity – barnacle settlement assays

Barnacle cyprids (larval settlement stage) settle in response to peptides with carboxy-terminal arginine or lysine residues, which are generated by trypsin-like serine proteases (Tegtmeyer and Rittschof, 1988 Pettis,1991). Therefore, settlement in response to small peptides in unpolymerized cement can be used as evidence for the activity of a trypsin-like serine protease in barnacle cement. All statistical analyses for settlement assays were conducted using SigmaStat® V. 3.10.0.

The response of barnacle cyprids to polymerizing cement taken from conspecific adults was tested using a series of settlement assays. Samples of 1, 3 or 6 μl unpolymerized cement were placed in a 5 cm polystyrene Petri dish (Falcon no. 351006) in 1 μl droplets. Immediately afterwards, 5 ml filtered, aged seawater was added to the dish. Approximately 20, newly metamorphosed (day 0) cyprids were added to each dish. Cyprids were allowed to settle for 24 h, over which time they were kept at 27–28°C on a 12 h:12 h light:dark cycle. Settlement treatments (1, 3 and 6 μl) along with controls (clean dish, no cement) were conducted in duplicate. The entire assay was conducted three times.

Settlement in all dishes was quantified after 24 h. Cyprids that had clearly metamorphosed into a juvenile and cyprids that had cemented to the dish but had not yet metamorphosed were counted as settled. Barnacles were killed by adding a drop of formalin to each dish, and settled and unsettled individuals were counted on a dissecting microscope.

Electrophoresis of cement with soybean trypsin inhibitor

Barnacle cement polymerizes rapidly. As polymerization proceeds, the intensity of bands resolvable with gel electrophoresis tends to decrease,since aggregated/cross-linked proteins become too large to enter the gel. If a reagent inhibits an enzyme involved in cement polymerization, then after a given incubation time the protein banding pattern should be stronger with than without inhibitor. The effect of trypsin inhibitor (soybean, Sigma-Aldrich no. 93620) on cement polymerization was tested using SDS-PAGE (under reducing conditions). A 1 μl sample of unpolymerized cement was added to 2 μl of trypsin inhibitor solution (250 ng ml –1 initial concentration). As a control, 1 μl unpolymerized cement was added to 2μl deionized water. Samples were vortexed and incubated on ice for 2 min. After 2 min incubation, reducing sample buffer was added, samples were heated,run on SDS-PAGE, and stained/destained as described above. Four replicate trypsin inhibitor treatments and four deionized water controls were conducted. Gels were photographed after destaining with a digital camera. To allow comparison of protein band intensity among lanes, each gel lane was analyzed for pixel intensity using Scion Image® V. Alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation, Frederick, MD, USA). The intensity of prominent protein bands(specifically those at 175, 125, 100, 90, 80, 68, 52, 38, 32, 28 and 25 kDa)was compared statistically between trypsin inhibitor treatments and deionized water controls using SigmaStat® V. 3.10.0.

Western blotting for human transglutaminase (factor XIII A1 subunit)

Tandem mass spectrometry identified the presence of transglutaminase(factor XIII A1 subunit precursor) in barnacle cement. Western blotting was used to verify the mass spectrometry results. Cement samples (1 μl) were denatured in 20 μl reducing sample buffer containing 10% (w/v) SDS and 5%(v/v) 2-mercaptoethanol and heated at 100°C for 4 min. After denaturing treatment, samples were sent vía overnight mail to the University of Puerto Rico for western blotting.

At the University of Puerto Rico, samples were run on a 10% acrylamide gel at four sample concentrations: the full cement sample (20 μl containing 1μl cement), 3 μl sample, 2 μl sample and 1 μl sample. The gel was run at 60 V for 30 min and then 150 V until the dye front had run out of the gel. Cement proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane in Tris-glycine transfer buffer containing 16% methanol. Protein transfer was conducted at 300 mA for 2 h at 4°C. Following protein transfer, the nitrocellulose membrane was placed in blocking solution (containing 5% non-fat dry milk) for 1 h. Rabbit polyclonal antibody to human factor XIII A subunit(GeneTex Inc., no. GTX72947 Irvine, CA, USA) was used as the primary antibody at 1:500 dilution. Goat anti-rabbit HRP-conjugated antibody (Chemicon,Millipore) was used as the secondary antibody at 1:2000 dilution. Following staining, the membrane was incubated in ECL Plus (GE Healthcare, Little Chalfont, Bucks, UK) for 2 min and then exposed to film. Control staining for non-specific binding was conducted with secondary antibody only. Staining was optimal when the full cement sample was used.

Quantification of transglutaminase activity

Transglutaminase activity in unpolymerized cement was quantified using a transglutaminase assay kit (Sigma-Aldrich no. CS1070). Assays were based on the reaction of transglutaminase with a cadaverine-coated 96-well plate 1μl unpolymerized cement was used for each test well. Cement was first added to assay buffer in a microfuge tube and vortexed. Cement in assay buffer was held on ice until all cement samples had been collected, at which time assay buffer containing cement was transferred to plate wells. Substrate only (no enzyme present) and positive controls (2 mU ml –1 transglutaminase from guinea pig liver), each in triplicate, were run along with barnacle cement samples. Since quantification of transglutaminase was based on peroxidase-conjugated streptavidin, and we have observed endogenous peroxidase activity in barnacle cement(Dickinson, 2008) (and G.H.D.,B.O. and D.R., in preparation), optical density at 450 nm (OD450)values were corrected for barnacle endogenous peroxidase activity. To enable this correction, substrate only and cement were run in wells without streptavidin–peroxidase added. Absorbance due to barnacle cement endogenous peroxidase was calculated as the OD450 value for cement without streptavidin–peroxidase minus mean OD450 for substrate only without streptavidin–peroxidase. The peroxidase correction for each individual was subtracted from the OD450 for cement run with streptavidin–peroxidase.

Hemocytes in cement droplets

The presence of hemocytes (a potential source of transglutaminase) in cement droplets was verified and quantified using a hemocytometer (American Optical Corporation, no. 1483 Greenwich, CT, USA). Heparin (ammonium salt,porcine intestinal mucosa, Sigma no. H 0880) was used as an anticoagulant to reduce the rate of cement polymerization. A 1 μl droplet of 1 mg ml –1 heparin was first placed onto the counting grid 1 μl cement was added to the heparin solution immediately after removal from the barnacle base and a coverslip was placed over the cement–heparin solution. The hemocytometer was placed on a compound microscope under phase contrast optics and photographed using a digital camera. Cell counts were made by reviewing these images on a computer monitor. Cells were classified as hyaline, granular or `agglomerations' based on morphology as described in Bauchau (Bauchau, 1981) and Hose et al. (Hose et al.,1990). Cells were scored as agglomerations when they appeared as a clumping of several smaller cells. Hemocytes from six different cement droplets were counted.

Identification of ϵ-(γ-glutamyl)lysine cross-links in barnacle cement

Transglutaminase activity results in the formation ofϵ-(γ-glutamyl)lysine cross-links(Pisano et al., 1968). The chemical method described by Pisano and colleagues(Pisano et al., 1969) was used to identify these cross-links in barnacle cement. This method is able to distinguish Lys that is bound specifically in ϵ-(γ-glutamyl)lysine cross-links from Lys that is not cross-linked. Proteins are subject to cyanoethylation and then acid hydrolysis. Lys residues with a free amino group(non-cross-linked) are converted to norte-carboxyl derivatives upon cyanoethylation and are not detected during amino acid analysis. Lys residues that are cross-linked are released as free Lys.

Polymerized cement was obtained by scrapping off and pooling the soft,opaque cement that is formed by some barnacles when attached to silicone substrates (Wiegemann and Watermann,2003 Holm et al.,2005). After collection, cement was rinsed with deionized water and lyophilized. A total of 11.3 mg of lyophilized cement was collected. Roughly half of the collected cement (5.5 mg) was subject to cyanoethylation,whereas the remaining 5.8 mg was left untreated. For cyanoethylation, 20 μl triethylamine and 200 μl acrylonitrile were added to the 5.5 mg cement sample, which was then incubated at 37°C for 104 h in a sealed ampoule under N2, as described by Pisano and colleagues(Pisano et al., 1969). These reaction conditions have been optimized for clotted fibrin by Pisano and coworkers (Pisano et al.,1969), ensuring that the cyanoethylation reaction would go to completion and that all free Lys would react. The cyanoethylated sample and the untreated cement sample were sent to the University of California at Davis Protein Chemistry Facility, where acid hydrolysis (6 mol l –1 HCl/0.1% phenol, 110°C, 24 h) and amino acid quantification were conducted.

Electrophoresis of cement with Ca 2+ chelators

The effect of divalent cation chelators on cement polymerization was tested using SDS-PAGE (under reducing conditions), as described above for soybean trypsin inhibitor. EGTA (Sigma-Aldrich no. E4378) and EDTA (Fisher Chemical,no. BP118) were used. The initial concentration of EGTA and EDTA solutions was 1 mg ml –1 (stirred for at least 30 min before use). Three replicate EDTA and EGTA treatments were conducted. As described for trypsin inhibitor, the intensity of prominent protein bands (specifically those at 175, 125, 100, 90, 80, 68, 52, 38, 32, 28 and 25 kDa) was compared statistically between EDTA or EGTA treatments and deionized water controls using SigmaStat® V. 3.10.0.


SDS gradient gel electrophoresis of proteins

As voltage is applied, the anions (and negatively charged sample molecules) migrate toward the positive electrode (anode) in the lower chamber, the leading ion is Cl¯ ( high mobility and high concentration) glycinate is the trailing ion (low mobility and low concentration). SDS-protein particles do not migrate freely at the border between the Cl¯ of the gel buffer and the Gly¯ of the cathode buffer. Friedrich Kohlrausch found that Ohm's law also applies to dissolved electrolytes. Because of the voltage drop between the Cl- and Glycine-buffers, proteins are compressed (stacked) into micrometer thin layers. [ 23 ] The boundary moves through a pore gradient and the protein stack gradually disperses due to a frictional resistance increase of the gel matrix. Stacking and unstacking occurs continuously in the gradient gel, for every protein at a different position. For a complete protein unstacking the polyacrylamide-gel concentration must exceed 16% T. The two-gel system of "Laemmli" is a simple gradient gel. The pH discontinuity of the buffers is of no significance for the separation quality, and a "stacking-gel" with a different pH is not needed.


Ver el vídeo: How to Make an SDS-PAGE gel (Noviembre 2022).