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Cómo eliminar carriles defectuosos en el análisis ImageJ Westernblot

Cómo eliminar carriles defectuosos en el análisis ImageJ Westernblot


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Utilizo ImageJ para hacer un análisis de una imagen de Westernblot.

Si todo sale como se desea, el flujo de trabajo está bien. Pero si hago algo mal al crear un carril, no se puede deshacer un carril y tampoco hay forma de eliminar todos los carriles que pueda encontrar.

¿Cómo vuelvo a mi imagen original o deshago la creación de un carril?

Estoy usando 1.49e en Mac OS


ImageJ no tiene una función para eliminar carriles individuales. Pero eso no debería ser un problema. Todo lo que tienes que hacer es dibuja el primer carril correctamente (Me refiero al tamaño). Entonces presione 1. Ahora, mientras la selección aún está ... seleccionada, haga clic dentro de ella, pero no en el número (donde el cursor se convierte en mano), y arrástrelo donde desee el siguiente carril. Y presione 2. Etcétera. Dibuja todos tus carriles.

Ahora, si perdió un carril, haga clic en la herramienta de selección de rectángulo, luego haga clic en el número de carril mientras el cursor es una mano. Será seleccionado. Si tiene problemas con esto, use los atajos Ctrl + 1 y Ctrl + 2 o el menú Analizar - Geles - Seleccionar carril anterior / siguiente para seleccionar entre carriles. El cursor se vuelve normal. Haga clic en cualquier lugar dentro del carril y arrástrelo al lugar correcto.

Si el primer carril estaba en mal estado y desea eliminar todos los carriles, vaya a Analizar, Geles y haga clic en Reiniciar.


Investigación imparcial

Como científico molecular, realizo muchas transferencias de Western. Como sabrá, los western blots son bastante inútiles a menos que pueda cuantificar la diferencia entre los carriles. La imagen J (o FIJI) se utiliza con frecuencia para cuantificar los resultados de las transferencias Western. Sin embargo, siempre me ha preocupado que haya múltiples formas de introducir sesgos en su cuantificación con este programa. Me he preguntado si la misma persona analizara el mismo western blot varias veces, ¿obtendrían los mismos valores cada vez? Para explorar esto, decidí utilizar una vieja imagen de western blot y ver qué valores diferentes podía obtener sin intentar ser sesgado.
Para empezar, utilicé la mancha occidental a continuación. Dado que esto fue solo un ejercicio de intriga, solo analicé las bandas superiores en las últimas tres columnas.

6 comentarios:

Este es un análisis realmente interesante, del que siempre me he preguntado. Tiene sentido que haya variación entre sus intentos debido al área alrededor de la banda, y me pregunto si sería posible tener eso en cuenta cuando esté haciendo un análisis de transferencia de Western. ¿Algo así como una réplica técnica de la selección de área? Como mencionó, es importante corregir el ruido y ese es otro paso adicional de variación y sesgo potencial. Tengo curiosidad por saber si hizo el mismo análisis con un control de carga y luego normalizó la señal. Me doy cuenta de que esto fue solo un experimento rápido de intriga, y parece que tal vez esa banda superior es el control, o una banda falsa. Independientemente, su análisis podría mostrar las consecuencias de este tipo de análisis, y hace
Me pregunto si el control de carga ayudaría. O si solo fuera otra capa de sesgo de selección de área.
Esto también saca a la luz un punto que a veces dependemos en gran medida de la "importancia estadística" de estas intensidades de banda. Nuevamente, todo esto es solo yo observando esta banda sin saber la relevancia científica (o realmente el experimento en absoluto), pero cuando miro esas bandas no veo una diferencia en las intensidades. Dado que su análisis dice que sí, es importante saber si esta diferencia es biológicamente relevante.

Encuentro esta publicación extremadamente interesante, mi laboratorio es un laboratorio de fisiología y tratamos de no hacer transferencias occidentales a menos que sea absolutamente necesario. Recientemente tuvimos que realizar un par (siempre tratando de complacer a los revisores) y mientras analizaba los datos usando ImajeJ comencé a preguntarme exactamente lo mismo. A pesar de que los carriles son paralelos una vez que toma la fotografía, debe tener en cuenta el ruido, la cantidad de proteína cargada en su gel y, como mencionó, el sesgo creado cuando es responsable de seleccionar el área correcta para la cuantificación. Aunque a veces se pueden detectar diferencias en la cantidad de proteína a simple vista con el software, debemos ser conscientes del sesgo que introducimos.
Como mencionó Amanda, ¡toda la cuantificación se remonta al significado y al mágico p & lt0.05! Sin embargo, ver para creer, así que cuando vemos que su carril 1 tiene una banda más delgada en comparación con el carril 6, ¿podemos tomar eso como experimentalmente relevante? ¿O estaremos siempre atrapados en el paradigma de la significación?

Esta es una publicación realmente interesante para mí, ya que me lo he estado preguntando durante bastante tiempo cuando hice Western Blot por primera vez y me dijeron que podía usar ImageJ para analizar las bandas. En realidad, he hecho muchas manchas en los últimos años, pero solo unas pocas veces cuando realmente usé ImageJ y quería ver las diferencias en la intensidad. Esto no significa que no sea útil en absoluto, pero recomendaría usar ImageJ para analizar la intensidad de la banda con precaución.

Hay un par de factores que podrían complicar el análisis de ImageJ. Lo primero es la sensibilidad de su reactivo de revelado y películas o del sistema de imágenes que utiliza. Hay múltiples opciones afuera y lo que usamos en nuestro laboratorio es un sistema de película tradicional y no es tan sensible para distinguir una ligera diferencia. En realidad, un miembro de nuestro laboratorio probó una vez el control de carga, donde cargó los mismos lisados ​​de proteínas en cantidades más pequeñas, digamos, 2ug, 4ug, 8ug, 20ug. Luego hizo la mancha y analizó con ImageJ y no vio que la intensidad aumentara en los mismos pliegues que cargó en primer lugar. Las tendencias fueron correctas, definitivamente mayor intensidad con más carga, pero no fue el doble de intensidad en 4ug, o 4 veces en 8ug en comparación con la carga de 2ug. Por lo tanto, dudaría de la cantidad de inferencia realizada por el análisis de intensidad de ImageJ, y mucho menos de la realización de análisis estadísticos posteriormente en nuestro entorno de laboratorio.

La segunda cosa que tengo en cuenta es que incluso si tiene un sistema altamente sensible, debe asegurarse de que lo que compara se haya hecho en un experimento y se haya analizado de una sola vez para disminuir la posibilidad de error o sesgo. Como ha mostrado en el blog acerca de establecer la línea en la parte inferior para calcular el valor debajo de la curva, esto también podría ser complicado, ya que podría dibujar líneas bastante diferentes en diferentes períodos de análisis. Creo que esto está relacionado con una conferencia en nuestra clase en la que primero debe recopilar todos los datos que necesita, y luego sentarse y analizarlos siguiendo el plan.

Con todo eso, esa es la razón por la que mi asesor siempre dice: "No uses imageJ para analizar los datos y mostrar las estadísticas, primero debes persuadirme a través de mi globo ocular".

Gracias por hacer este trabajo de prueba de principio con ImageJ. Creo que es esencial que pueda establecer la validez de sus mediciones antes de que se utilicen para análisis experimentales y sacar conclusiones de ellas. Estas validaciones no siempre son del conocimiento del lector después de la publicación y me he preguntado acerca de la estandarización y cuantificación con otras técnicas. Nuestro programa recientemente tuvo un orador del seminario que dio una charla sobre enjambres de bacterias que se fusionan o no fusionan sus zonas de enjambre en placas de agar entre sí en función de la relación de las cepas. El comportamiento de "fusión" se denotó por si se formó una "línea de límite" entre las dos zonas de enjambre. Algunas imágenes de las líneas fronterizas no estaban claras y las distinciones no parecían absolutas. El establecimiento de un método confiable y preciso para determinar el comportamiento de la población, como usted ha validado ImageJ aquí, realmente habría aumentado mi confianza en los datos y conclusiones del orador. Tengo la esperanza de que a medida que nos desarrollemos como científicos, adoptemos el enfoque que ustedes han perseguido para lograr la integridad científica al validar nuestros métodos y conocer mejor las conclusiones para las que estamos calificados.

Con la cuantificación ImageJ de las transferencias occidentales, el principal problema con el que me encontré, como usted señala, es dónde trazar la línea para eliminar el ruido. Me enseñaron a dibujar la línea desde la meseta (que representa la línea de base / señal de fondo) en un lado del pico hasta la meseta en el otro, mientras que a la otra persona que analiza los datos se le enseñó a dibujar la línea desde los mínimos locales en uno. lado del pico hasta los mínimos locales en el otro lado del pico. A veces obtuvimos resultados muy diferentes, así que decidimos ejecutar una prueba t de dos muestras para los puntajes en algunos de nuestros westerns para ver si había una diferencia entre mi puntaje y el suyo. Descubrimos que existía y, en última instancia, tuvimos que estandarizar nuestros métodos de puntuación. Creamos un protocolo para tratar de abarcar la mayor cantidad de posibles variaciones y circunstancias que podamos encontrar y, en última instancia, nuestra puntuación ya no fue significativamente diferente. Sin embargo, en el proceso de creación de este protocolo, hablamos con varios postdoctorados y jóvenes investigadores que regularmente dirigían westerns y cada uno de ellos tenía sus propias variaciones sobre cómo realizar este análisis. No conozco un protocolo formal para el análisis ImageJ de Westerns, pero como rara vez (si es que alguna vez) se informa en los métodos, cómo se realizó este análisis (aparte de que realizaron análisis cuantitativos utilizando ImageJ) y dado el grado en que los puntajes pueden variar. sus métodos quizás sea necesario un protocolo más formal. Si los datos en sí mismos están sesgados, ningún tipo de estadística puede corregirlo por completo.
La forma en que nuestro laboratorio quizás tuvo en cuenta esto fue el estándar que usamos en cuanto a datos occidentales publicables fue que, si bien es importante hacer un análisis cuantitativo en los westerns, si no puede ver el resultado cualitativamente (es decir, solo puede ver esa banda los tamaños son diferentes a simple vista), especialmente dado el grado de variación presente en nuestros métodos de análisis, su resultado es mucho menos creíble y quizás debería tomarse con un grano de sal y, por lo tanto, no se consideraría publicable. Me interesaría saber cuál es la práctica de los laboratorios de aquellos de ustedes que dirigen westerns con respecto al análisis cualitativo frente al cuantitativo.

Los westerns eran mi pan y mantequilla en la licenciatura e incluso entonces cuantificarlos me ponía nervioso de una manera que los diagramas de flujo todavía no lo hacen ahora. Siempre se siente como una publicación de métodos #demasiado honestos para decir que observaste el nivel de ruido. Los westerns también siempre me preocupó por el hecho de que después de cierto punto, se pierde una señal más alta ya que la película está tan revelada como puede ser, y la parte actualmente expuesta es lo suficientemente grande como para limitar el área a su alrededor que también puede reaccionar. Los westerns siguen siendo una gran herramienta, pero me gustaría que tuviéramos métodos de cuantificación menos directos para interpretarlos, o dependiéramos menos de esas cuantificaciones frente a presencia / ausencia o diferencias obvias sangrientas.


¿Cómo determinar la intensidad de la banda de Western blot? - Estudiante de secundaria que necesita ayuda para la Feria de Ciencias & # 33 (03 / Febrero / 2005)

Estoy haciendo un experimento con Western Blot para mi proyecto de feria de ciencias.

Escuché que para producir un gráfico, la intensidad de las bandas debe evaluarse usando adobe photoshop 5.5 o 7.0. Me preguntaba si alguien me puede decir, por favor, paso a paso, ¿cómo proceder para obtener los píxeles / intensidad de las bandas generadas con el programa?

Gracias & # 33 Agradezco la ayuda & # 33

Escuché que esto se puede hacer con Photoshop, pero no tengo experiencia de primera mano en eso. en nuestro laboratorio usamos ScionImage de Scion Corp.

Puede obtener esto aquí, aunque solo se brinda asistencia a los clientes que pagan.

pero luego, tal vez venga alguien que use PS para la cuantificación y pueda ayudarlo.

Hola
No voy a decirles el procedimiento, pero quiero señalar la calidad de la cuantificación. Sinceramente, el único método que he escuchado consiste en cargar en el MISMO GEL sus extractos y una cantidad conocida de proteínas 2, 4, 6, 8, etc. con diferentes proteínas de diferente peso molecular y si usa anticuerpos, para revelar su película. con el mismo tiempo de exposición (en la práctica eso dice una correvelación). Si solo desea un valor aproximado (pero no tan malo), puede usar Photoshop como dice jadefalcon.

Lo primero que tienes que hacer es conseguir una buena exposición de tu gel. Esto significa que NO se sobreexpondrá. La regla general es que debe poder ver a través de las bandas (es decir, colóquelo contra una hoja de papel y vea si puede leer algo de texto a través de él ...)

En segundo lugar, TODAS las bandas que quieras comparar deben estar en la misma película. La cuantificación es relativa a una banda que pones como 1 (o 100%).

1) En PS, carga tu imagen
2) Luego haz, Image & gtAdjust & gtInvert (de esta manera, inviertes la escala)
3) Dibuje un cuadro, que cubra UNA banda usando la herramienta Marquesina (haga primero la banda más grande, ya que el cuadro TIENE que ser del mismo tamaño durante todo el análisis. De esta manera, no tiene que tener en cuenta el tamaño del cuadro )
4) Luego haga, Image & gtHistogram y escriba la Media
5) Luego arrastre el cuadro a la siguiente banda y repita
6) Finalmente, arrastre el cuadro para medir la Media del Fondo y reste el número de todos los demás.
7) Divida todos los números con su número de referencia para el que está configurado como 1 (o 100%)

Esta es una forma MUY aproximada de hacerlo, pero le da algunas pistas sobre el aumento / disminución relativo de la expresión.

Solo recuerde que cuando crea una imagen digital de su película usando un escáner, necesita crear una imagen de la más alta calidad posible. Escaneamos nuestras películas en escala de grises y producimos un archivo TIFF con una resolución de 1200 ppp.

No hagas un jpeg de tu película, los jpegs contienen muchos menos datos de imagen que los archivos tiff.

Lo intentaré usando la imagen de Scion de arriba. No tengo ninguna experiencia en el uso de Photoshop para cuantificar las bandas.

Cargue el archivo tiff en la imagen de Scion. Nunca he usado una imagen de vástago, pero el principio que supongo sería el mismo en cualquier programa de imágenes. Estoy seguro de que este método está lejos de ser perfecto, pero podría funcionar para usted.

Primero dibuje un cuadro en un área que no tenga bandas y seleccione analizar- & gtmedida. Esto le dirá la intensidad de fondo de su imagen (media), y también el área de su cuadro. Escriba estos números.

A continuación, dibuje un ROI (región de interés) alrededor de una banda que desee medir y seleccione analizar- & gt medir. Nuevamente obtendrá una medición de área y una medición de intensidad media. Anote estos números. Repita esto para todas las bandas que desee medir.

Tenga cuidado al hacer sus ROI y experimente I & # 39d dibujando ROI y comparando los valores que obtiene de ellos hasta que crea que puede dibujarlos correctamente y obtener una medición precisa.

Puede que me equivoque, pero para cuantificar sus bandas, deberá multiplicar la intensidad media y el área para obtener el número que desea. Haga esto también para su fondo. Anote estos números.

A continuación, reste el valor de fondo (área x intensidad media) de cada uno de los valores de su banda (área x intensidad media)

Hágame saber si esto tiene sentido. Además, si alguien puede mejorar mi método descrito, no dude en hacerlo.

No estoy seguro de cómo cuantificar la intensidad de las bandas, pero existe un software gratuito llamado ImageJ (de los NIH) que se puede descargar de Internet y que nuestro laboratorio utiliza para realizar análisis densitométricos de nuestras transferencias Western.

¿Por qué no proporcionar una dirección exacta?

nyg1234-
tenga en cuenta la fecha de esa última publicación

Sospecho que podrías encontrar la dirección si usaras Google. o, alternativamente, buscó en el sitio de los NIH?

Otro sobre cuantificación de western blot y Scion Image (o ImageJ) ...

Aquí hay una ilustración de los resultados que obtengo:

Con resultados como los ilustrados en la imagen, ¿no sería mejor tener en cuenta el tamaño (área) de la banda y no solo su intensidad?

Tengo muy poca experiencia en el uso de Scion Image pero, cuando utilizo Gelplot Macro, solo puedo seleccionar los diferentes carriles con la herramienta de selección rectangular y el tamaño de la selección rectangular debe ser el mismo para cada carril.

En lugar de dibujar el área de interés, me gustaría usar la selección de varita mágica, pero esto implica limitar la imagen, ¿es una buena idea?

¿Aplica algún tipo de modificación (umbral / realce de contraste /…) en la imagen antes de las mediciones?

En lugar de restar un solo valor de fondo para toda la película (de una selección rectangular tomada en cualquier parte de la película), ¿es una buena idea o una pérdida de tiempo restar un valor de fondo a cada línea (tomado justo encima o debajo del correspondiente carril) .


Introducción

Las células están reguladas de acuerdo con el dogma central, que es el flujo de la información genética a la expresión de proteínas. Los niveles de expresión de las proteínas dictan el destino celular, por ejemplo, los niveles de expresión de ciertos factores de transcripción regulan la diferenciación del músculo esquelético [1]. Por lo tanto, es fundamental cuantificar la expresión de proteínas para comprender los fenómenos celulares o el potencial a nivel molecular. Western blot es el método estándar para cuantificar la expresión de proteínas [2]. El método de quimioluminiscencia se utiliza generalmente para detectar proteínas debido a su alta sensibilidad y facilidad de uso [3, 4]. Sin embargo, los desarrollos recientes en proteómica se han centrado en tecnologías para detectar la expresión de múltiples proteínas simultáneamente, a diferencia del método de quimioluminiscencia que detecta proteínas individuales. Un método para la detección simultánea de múltiples proteínas que permite un análisis más cuantitativo es el Western Blot fluorescente [5-7]. Sin embargo, la sensibilidad de detección de este método es menor que la del método de quimioluminiscencia.

En este estudio, para mejorar la resolución y la sensibilidad de la transferencia Western fluorescente, nos centramos en el paso de microscopía de fluorescencia. La cámara CCD del microscopio es capaz de capturar imágenes de alta resolución, pero tiene un campo visual pequeño. Por lo tanto, capturamos una imagen con una alta resolución y un campo amplio fusionando múltiples micrografías de fluorescencia. Además, aumentamos con éxito la sensibilidad de detección a un nivel comparable al del método de quimioluminiscencia optimizando los filtros y tintes fluorescentes.


Formas de eliminar la autofluorescencia

Si tiene problemas con la autofluorescencia, lo primero que debe hacer es intentar aislar la causa investigando su muestra. Cuando comience sus experimentos, ejecute un control sin etiquetar para determinar si existe alguna contribución a la fluorescencia de fondo del procedimiento de tinción.

También es importante conocer los espectros de su autofluorescencia. Esto se puede determinar mediante exploración lambda espectral. El escaneo espectral ayudará con la optimización del experimento y evitará fuertes picos de autofluorescencia.

Una vez que tenga una buena idea de los espectros de su autofluorescencia, la siguiente etapa es optimizar sus opciones de fluoróforos. Si los espectros de la autofluorescencia y su fluoróforo se superponen muy de cerca, existe una alta probabilidad de que su señal quede enmascarada por la autofluorescencia. En este caso, seleccione un fluoróforo con espectros alejados de su autofluorescencia de fondo. Por ejemplo, si su autofluorescencia está en la región azul del espectro, mueva su fluoróforo al verde o al rojo.

Al seleccionar fluoróforos, elija una sonda moderna como Alexa Fluor, Dylight o Atto. Estos tintes tienden a ser más brillantes, más estables y tienen bandas de excitación y emisión más estrechas, lo que facilita la selección solo de la señal de su fluoróforo. Si su microscopio puede detectarlos, los tintes de color rojo lejano son una muy buena manera de evitar problemas con la autofluorescencia, ya que estas longitudes de onda rara vez se encuentran en muestras biológicas. Ser capaz de detectar tintes de color rojo lejano tiene el beneficio adicional de poder expandir el número de canales que se pueden usar para experimentos multicolores.

Con un fluoróforo seleccionado, es importante no ejecutar su experimento a ciegas con las concentraciones que figuran en el tubo. La mayoría de las veces, será necesaria una titulación del fluoróforo, probando diferentes concentraciones en su muestra. Esto le permite ver qué concentraciones le brindan la mejor diferenciación de su fondo y la autofluorescencia más baja. Utilice las instrucciones del fabricante como guía y cree una serie de diluciones del fluoróforo para cubrir un rango ligeramente por debajo y ligeramente por encima del uso recomendado. Pruebe estas diluciones con su muestra para determinar cuál le dará la señal más útil.

Optimice la configuración de su microscopio

La configuración de su microscopio confocal juega un papel muy importante en el que las señales son visibles en su imagen, incluida la autofluorescencia. Utilice estos ajustes a su favor para cortar la mayor cantidad posible de señal de autofluorescencia adaptando la detección espectral. Hay diferentes formas de hacer esto según el microscopio, pero la opción más flexible es elegir un láser de luz blanca junto con un detector espectral. Esto significa que puede sintonizar con precisión las longitudes de onda de la luz que llegan a su muestra, así como las longitudes de onda que pasan a través del detector. Esto permite un control muy fino al seleccionar qué señales se registran en la imagen capturada y brinda una amplia oportunidad para eliminar la autofluorescencia.

Figura 1: al comparar los espectros de autofluorescencia y el fluoróforo, elija un fluoróforo que no se superponga con la señal de autofluorescencia.

Tratar su muestra para evitar la autofluorescencia

La autofluorescencia con frecuencia no proviene de la muestra, sino de la forma en que se trata antes de la obtención de imágenes. Por ejemplo, los medios de montaje, los medios de cultivo de tejidos y el plástico de laboratorio pueden ser fuentes de autofluorescencia.

Si está realizando experimentos de imágenes de células vivas, considere reemplazar su medio de cultivo normal con un medio sin rojo fenol precalentado o una solución salina tamponada transparente antes de la imagen. Además del indicador de pH rojo fenol, que es altamente fluorescente cuando se excita a 440 nm, los medios de cultivo y los suplementos como FBS pueden contener muchas proteínas y moléculas pequeñas con señales fluorescentes propias, todo lo cual puede sumarse a un fuerte fondo de autofluorescencia. si no se eliminan. Si decide cambiar sus células a un nuevo tipo de medio para obtener imágenes en vivo, es importante tener en cuenta que esto podría causar cambios inesperados en el comportamiento y el fenotipo celular, por lo que, dependiendo de lo que esté estudiando, es posible que deba adaptar las células a el nuevo medio primero.

También vale la pena medir la autofluorescencia de los platos de imágenes que está utilizando con la misma configuración de microscopía para ver si se trata de una fuente de autofluorescencia. Si es así, intente obtener imágenes utilizando platos de cultivo con ventanas de vidrio o platos con fondo de vidrio que están especialmente diseñados para eliminar
señales de autofluorescencia.

También se pueden observar problemas similares cuando se toman imágenes de biopsias y muestras de tejido que han estado expuestas a sustancias químicas. Un ejemplo común es el tracto digestivo, que puede tener grandes cantidades de autofluorescencia si se expuso a antibióticos como la tetraciclina que tienen una marca fluorescente fuerte. En este caso, la fluorescencia se puede eliminar fácilmente mediante un enjuague completo con solución salina tamponada o el uso cuidadoso de disolventes.

Si está arreglando células, el método de fijación puede tener un gran impacto en la autofluorescencia. Considere alternativas a la formalina y el glutaraldehído, y trate de no almacenar muestras fijas durante demasiado tiempo antes de la obtención de imágenes, porque la autofluorescencia puede aumentar con el tiempo.

Si bien es óptimo omitir la autofluorescencia mediante el diseño experimental, algunas veces simplemente no es posible. En estos casos, puede haber soluciones computacionales a sus problemas de autofluorescencia. Usando su software de microscopía o soluciones de código abierto como ImageJ, es posible analizar los píxeles que contienen la autofluorescencia e intentar restar esto de la imagen general [1]. Sin embargo, tenga en cuenta que los enfoques computacionales pueden ser complejos. Hay muchos métodos y algoritmos diferentes para elegir, por lo que es una buena idea probar algunos para ver cuál funciona bien. Es importante recordar que estos métodos a menudo pueden reducir la fuerza de la señal de fluoróforo, así como la autofluorescencia, así que utilícelos con cuidado y tenga en cuenta que a menudo existe una compensación entre aumentar el contraste con el suelo de fondo y reducir la intensidad de la señal.

Eliminar la autofluorescencia después de la fijación

Una vez que tenga sus muestras preparadas y almacenadas en el congelador, puede parecer que cualquier autofluorescencia está ahí para quedarse. Si bien es más fácil eliminar la autofluorescencia en las etapas de preparación de la muestra, ciertamente hay pasos que se pueden tomar incluso en etapas posteriores del proceso.

Existen muchos tratamientos químicos que pueden atenuar las señales de autofluorescencia. Algunos de estos están disponibles comercialmente, mientras que otros pueden prepararse fácilmente utilizando productos químicos de laboratorio comunes como borohidruro de sodio, negro B de Sudán, etanol de amonio, etc. [2,3].

El fotoblanqueo tiende a tener connotaciones negativas en microscopía, ya que se asocia con la pérdida de la señal fluorescente después de pasar mucho tiempo buscando la mejor imagen con el láser encendido un poco demasiado alto. Sin embargo, para la autofluorescencia, el blanqueamiento puede ser tu amigo. Antes de agregar sus fluoróforos, puede tratar su muestra con luz LED de alta intensidad para blanquear toda la autofluorescencia de fondo. Posteriormente, el fluoróforo elegido debería contrastar mucho más con el fondo blanqueado [4].


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Este ejercicio de laboratorio tarda 2 o 3 períodos de laboratorio en completarse (consulte la Tabla I para ver el cronograma). El primer día, los cultivos de caldo LB líquido (2 ml) se inoculan a partir de colonias aisladas en placas previamente sembradas e incubadas por el profesor asistente o instructor. En los momentos deseados (ya sea junto con la inoculación inicial, que es lo que hemos hecho de forma rutinaria, o después de un tiempo específico de crecimiento), se agrega inductor al cultivo (IPTG para el laca operón en células DH5α, arabinosa para el plásmido pGLO en células HB101), y se continúa la incubación a 37 ° C con agitación. Después del tiempo designado de incubación (5 o 6 h hasta toda la noche), se transfieren 1,5 ml de cultivo a un tubo de microcentrífuga y las células se sedimentan mediante centrifugación a velocidad máxima durante 2 min. Tras la resuspensión en tampón de carga 1 × SDS, las muestras pueden cargarse directamente en geles de poliacrilamida para electroforesis o almacenarse a -20 ° C hasta su uso. La electroforesis y el procesamiento se pueden realizar el mismo día, pero si es así, la transferencia de proteínas a la membrana de PVDF también debe realizarse el mismo día. Después de la transferencia, la membrana puede almacenarse a 4 ° C durante 1 o 2 días, o puede llevarse directamente al paso de bloqueo seguido de incubación durante la noche con el anticuerpo primario. Todos estos pasos se pueden llevar a cabo en un período de aproximadamente 3 ho dividido en 2 días. El lavado, la incubación con el anticuerpo secundario y el revelado con el sustrato quimioluminiscente deben realizarse en 1 día y también deben tomar alrededor de 3 h.

Resultados típicos de estudiantes para el análisis de laca el control del operón se muestra en la Fig.3A. Como puede verse fácilmente, hay un aumento en la señal para la proteína β-galactosidasa en presencia del inductor de IPTG, pero todavía hay una cantidad significativa de señal en ausencia de inductor. Esta diferencia es más notable para las muestras cultivadas durante tiempos más cortos (5 o 6 h en comparación con 10 h). Esta diferencia no se debe a diferencias en la proteína total, como puede verse al comparar la cantidad de proteína en cada carril en un gel teñido con azul de Coomassie idéntico (Fig.3B). Para cultivos de una noche, hay menos diferencia en la señal para la β-galactosidasa entre las muestras de proteínas inducidas y no inducidas (Fig. 4). Estos resultados están de acuerdo con los hallazgos publicados de que el control disminuye en cultivos en fase estacionaria [5].

Análisis de transferencia de Western de la expresión de β-galactosidasa en células bacterianas inducidas y no inducidas. A, Las células DH5α se incubaron en presencia (+) o ausencia (-) del inductor de IPTG como se describe en “Materiales y métodos” durante los tiempos indicados en la fondo de la figura. La proteína total se recuperó y se separó mediante SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de PVDF y se incubó con anticuerpo anti-β-galactosidasa de ratón. La detección se realizó por quimioluminiscencia utilizando un anticuerpo anti-HRP de ratón. B, Gel teñido con azul de Coomassie que muestra la proteína total de células inducidas (+) y no inducidas (-). El gel se cargó de forma idéntica al gel utilizado para la transferencia Western que se muestra en A. METRO, proteínas marcadoras incluidas en el gel (marcadores no teñidos Bio-Rad Precision, con pesos moleculares de cima para fondo de 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10 kDa).

Western blot de expresión de β-galactosidasa en cultivos durante la noche (fase estacionaria). Como puede verse, parece haber menos diferencia entre las muestras de proteínas inducidas y no inducidas.

Los resultados de las transferencias Western de estudiante del operón arabinosa se muestran en la Fig. 5. Los dos primeros carriles contienen proteínas totales de lisados ​​celulares de cultivos nocturnos desarrollados en presencia (+) y ausencia (-) de arabinosa, el inductor del operón. La transferencia se incubó con anticuerpos policlonales contra GFP, que es el producto del gen informador unido al promotor de arabinosa en la construcción. Se observa una fuerte señal para el tamaño de GFP para la muestra inducida, mientras que no se observa ninguna señal detectable en el carril no inducido. La banda de mayor peso molecular es una proteína no relacionada que reacciona de forma cruzada con el anticuerpo. Algunas muestras se sometieron a inmunoprecipitación para concentrar la GFP, como puede observarse por la banda de GFP muy concentrada en el carril IP + (Fig. 5). Para el cultivo durante la noche desarrollado en ausencia de inductor de arabinosa, se detecta una banda del tamaño apropiado, pero es mucho menos intensa en comparación con el carril de muestra inducido. La banda es casi indetectable en la muestra no inducida cultivada durante solo 5 h. Se observan variaciones entre muestras y pueden ser el resultado de diferencias en el tiempo de crecimiento hasta y después de la inducción y pequeñas diferencias en la temperatura de incubación. Otras diferencias posteriores a la incubación también podrían dar lugar a variaciones, incluida la sedimentación o resuspensión insuficiente de las células bacterianas, la desnaturalización incompleta de las proteínas antes de SDS-PAGE, errores en la carga del gel y los pasos de transferencia o postransferencia.

Análisis de transferencia Western de la expresión de GFP de un promotor inducible por arabinosa. La cepa huésped HB101 que lleva el plásmido pGLO se cultivó en presencia (+) o ausencia (-) del inductor de arabinosa durante la noche, las proteínas totales se aislaron como antes (para el panel izquierdo, etiquetado L para lisado), y las muestras se separaron mediante SDS-PAGE. Luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y se incubaron con anticuerpo anti-GFP de conejo como se describe en "Materiales y métodos". los panel derecho incluye muestras cultivadas en presencia (+) o ausencia (-) del inductor durante la noche o durante 5 h, como se indica, después de la concentración por IP. METRO es un carril marcador que contiene proteínas marcadas (se pueden observar los marcadores de 30 y 40 kDa). los flechas indican el tamaño de la proteína GFP de ∼29-kDa. Las bandas de mayor peso molecular aparentemente se deben a un artefacto de reacción cruzada de las células.

Posibles problemas / resolución de problemas

Weak signals may be due to one or more of the following: insufficient transfer from gel to membrane, incorrect transfer buffers, incubation with antibody was not long enough, or antibody is too dilute.

Too much background can result from using too much antibody or from allowing the membrane to dry out during the incubation steps. Enough solution should be used to keep the membrane completely submersed but without wasting excess solution and antibody. We have found that a pipette tip box lid is an ideal size for holding 20–30 ml of solution. The proper dilution of antibody needs to be empirically determined.

Suboptimal immunoprecipitation conditions may lead to reduced protein signal or an increase in nonspecific bands and background staining following Western analysis. Salt and detergent concentrations in the IP buffer can be adjusted as needed to maximize efficiency and specificity.

Questions for Classroom Discussion

What is the basis of any differences in the amount of β-galactosidase observed in Western blots relative to time of growth?

Does there appear to be more control of gene expression in the logarithmic stage of growth versus stationary phase?

Why should the time when inducer is added to the culture affect expression levels if the cells are grown to the same final density?

How might temperature of culture incubation affect expression what would be some possible reasons for altering the temperature?

Upon comparison, does the ara promoter show greater or lesser control over gene expression when compared with the laca promoter?

How does immunoprecipitation enhance detection levels of proteins?

When would laca promoter constructs have the advantage over ara promoter constructs?

For what applications would the ara promoter be most useful?

What modifications to either promoter might be useful to obtain optimal expression under specific growth conditions?


Resultados y discusión

Optimization of PCFT expression

In pilot studies where we varied the number of viral particles per cell (multiplicity of infection, MOI) and density of Sf9 cells grown in a 50-ml suspension culture, we found that PCFT expression was better at a MOI of 2 and a density of 2 x 10 6 cell/ml. Fig 1A shows PCFT expression under these conditions, as a function of time after infection. For each timed sample, we determined cell viability and PCFT expression by Western blot. PCFT expression peaked 48 h post-infection with a cell viability of

40%. In summary, the following conditions yielded the best PCFT expression: Sf9 cells infected at a density of 2 x 10 6 cell/ml with a MOI of 2 and harvested 48 h after infection.

A. Sf9 cells in 50 ml suspension culture at a density of 2 x 10 6 cells/ml were infected at a MOI of 2. One-ml whole cell samples were collected at the indicated time points, electrophoresed on a 4–15% Mini Protean TGX Precast SDS-PAGE gel (BioRad), transferred to a PVDF membrane, and immunoblotted using an antibody against the His6 tag of PCFT. PCFT bands were observed at

43 kDa. The highest PCFT expression was observed 48 h post infection. No PCFT expression was observed at the time of infection (0 h) or in uninfected cells after 48 h (uninf). B. Treatment of membrane vesicles with PNGase F under non-denaturing conditions shifted the PCFT band from

39 kDa (each lane treated with PNGase corresponds to a different sample preparation).

The whole cell samples used for the initial expression investigations yielded two close bands (

43 kDa) in Western blots. N-linked glycosylation of two asparagine residues within the first extracellular loop has been observed in recombinant human PCFT expressed in mammalian cells or Xenopus laevis oocytes [26, 31]. In these expression systems, treatment with PNGase F shifted the PCFT band in Western blots from

35 kDa. Insect cells can add compact, relatively homogenous α1–6 fucosylated Man3GlcNAc2 sugar moieties [32] of

16 kDa per glycosylation site [33]. Therefore, we suspected that the band with slower mobility in our blots corresponds to glycosylated PCFT localized at the plasma membrane, whereas the faster band corresponds to non-glycosylated PCFT. Isolation of membrane vesicles and solubilization yielded samples highly-enriched in the 43 kDa species (Fig 1B control). Consistent with glycosylation, PNGase treatment shifted the slower mobility band to a band of higher mobility (Fig 1B). In our hands, PCFT bands obtained from Sf9 whole cell lysates correspond to approximate molecular weights of 43 for glycosylated PCFT and 39 for deglycosylated PCFT.

Detergent screening for solubilization of PCFT

DDM has been widely used as a detergent to solubilize and study membrane proteins, including MFS transporters [34–43]. In pilot experiments to identify detergents suitable for solubilization of PCFT from Sf9 membranes we tested nine different detergents (concentrations in % w/v), including nonionic (0.5–2% DDM, 1–2% UDM, 0.5–2% DM, 1.25% and 4.5% OG, 1.25% NG, 1% DMNG) and zwitterionic detergents (0.5% AZ, 1% and 2.5% CHAPS and 1% FS-12). PCFT in Sf9 membranes was solubilized with these detergents, centrifuged at high-speed to separate solubilized proteins (supernatant) from unsolubilized material (pellet), separated by SDS-PAGE, and visualized by Western blot. The efficiency of solubilization was assessed by comparing the intensity of the PCFT band after solubilization to that of the control band (unsolubilized, non-centrifuged sample). PCFT in the Sf9 membranes was solubilized quantitatively (

90 to 100%) with 1 or 2% DDM, 1% FS-12 or 0.5% AZ (Fig 2). DDM consistently yielded very high efficiency in solubilization (> 70%). Based on this and its widespread use, we used DDM for all subsequent preparations.

Nine different detergents were used at the indicated concentrations to analyze solubilization of PCFT from membranes isolated from Sf9 cells. After a 2-h incubation, solubilized supernatants and pellets were analyzed using 4–15% MiniProtean TGX Precast SDS-PAGE gels, transferred to PVDF membranes and immunoblotted for detection with an antibody against the His6 tag of PCFT. First lane (Total protein) is the total amount of PCFT in Sf9 crude membranes before solubilization, and the second lane is a sample without detergent. (A) Non-solubilized pellets of the initial screen, (B) solubilized supernatants of the initial screen, and (C) solubilized supernatants with increased OG and CHAPS concentrations. See text for detergent abbreviations.

Affinity purification

We enriched PCFT from solubilized membrane proteins by liquid chromatography based on the affinity of its His6 tag for transition metals. The PCFT eluted from a TALON Co 2+ resin was significantly cleaner than that eluted from a resin containing immobilized Ni 2+ (data not shown). The His6-tagged PCFT eluted from the Co 2+ resin with 200 mM imidazole migrated at ca. 43 kDa in a 4–15% MiniProtean TGX Precast SDS-PAGE gel and showed a high degree of purity (Fig 3).

PCFT was reconstituted in liposomes as described in Experimental Procedures. Purified protein and reconstituted PCFT were subjected to SDS-PAGE (4–15% MiniProtean TGX Precast gel). (A) Protein staining (Stain-free gel, BioRad) and (B) Western blot of the same gel analyzed using an antibody against the His6 tag of PCFT. Lane 1: purified protein eluted from the Talon Co 2+ resin lane 2: PCFT reconstituted in proteoliposomes.

Size-Exclusion Chromatography (SEC) analysis

DDM-solubilized PCFT purified by immobilized Co 2+ affinity chromatography was purified further by SEC, with an overall yield of pure PCFT of

0.9 mg/l culture. Based on PCFT’s elution volume of 11.4 ml and the elution profiles of protein standards, the calculated molecular mass of the PCFT-DDM complex was

280 kDa (Fig 4) consistent with a large amount of detergent, as has been observed previously for other 12 transmembrane segment transporters [44]. Alternatively, our purified PCFT could be an oligomer, but this seems unlikely because we have shown that the monomer is the human PCFT structural/functional unit in membranes of mammalian cells and frog oocytes [26].

(A) Elution profile of PCFT solubilized in DDM. Elution volumes of standard proteins are indicated as follows: thyroglobulin (T, 669 kDa), ferritin (F, 440 kDa), aldolase (A, 158 kDa), conalbumin (C, 75 kDa), ovalbumin (O, 44 kDa). Blue dextran (BD, 2 MDa) was used for void volume determination. (B) PCFT fraction corresponding to the peak PCFT elution fraction was analyzed by protein staining (BioRad stain-free imaging). (C) The partition coefficients (KAV) of the standard proteins are plotted against the log of their molecular weights to calculate the size of the PCFT-DDM complex, yielding an apparent size of 280 kDa.

Functional characterization

Specific uptake of folic acid in Sf9 cells.

The uptake of 3 H-folic acid in Sf9 cells expressing PCFT and uninfected cells was measured over 10 min at pH 5.5 [29]. The time course of folic acid uptake was not examined in the present study, but Fig 5A shows that the uptake in cells expressing PCFT was significantly higher than in uninfected cells, and was reduced in the presence of a 200-fold excess of cold (unlabeled) folic acid (one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test, P < 0.0001). These data indicate that PCFT expressed at the plasma membrane in Sf9 cells is functional. Fig 5B shows that the uptake measured at pH 5.5 over 10 min was concentration dependent, with a Kmetro for 3 H-folic acid uptake of 1.94 ± 0.20 μM (n = 3). This Kmetro is similar to that reported in mammalian cells (1.7 μM in HEK 293 cells)[29] and X. laevis oocytes (1.3 μM)[9].

(A) 10-min uptake of 500 nM 3 H-folic acid (FA) by PCFT-expressing Sf9 cells determined at pH 5.5. Data are means ± SD. The value in Sf9 cells expressing PCFT (PCFT) was significantly different from that of uninfected cells (Control) (1-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test, P ≤ 0.0001, ****). Uptake was reduced significantly in the presence of a 200-fold excess of unlabeled folic acid (PCFT + Ex FA) (1-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test, P ≤ 0.0001, ****). The difference between the PCFT + Ex FA and Control was not significant (ns). (B) Concentration dependence of the 3 H-folic acid uptake in PCFT-expressing Sf9 cells (PCFT) and uninfected cells (Control). Data was fit using the Michaelis Menten equation (Graphpad Prism, San Diego, CA).

Functionality of lipid reconstituted PCFT.

Affinity purified PCFT was concentrated to 0.6 mg/ml and reconstituted in unilamellar liposomes as indicated under Experimental Procedures. The protein staining of SDS-PAGE gel and Western blot analysis in Fig 3 show the presence of PCFT in the proteoliposomes. PCFT function was demonstrated by the 30-s uptake of 300 nM 3 H-folic acid (Fig 6), where PCFT-proteoliposomes showed significantly higher uptake of 3 H-folic acid than liposomes (t-test: L vs. PCFT-PL P = 0.008, r 2 = 0.86 one preparation, n = 3). These results demonstrate reconstitution of functional PCFT in liposomes.

The 30-s uptake of 300 nM 3 H-folic acid (FA) into unilamellar PCFT-proteliposomes (PCFT-PL) was measured at pH 5.5. Unilamellar empty liposomes (L) served as control. The uptake in PCFT-PL was significantly higher than that in liposomes (t-test: L–PCFT-PL P = 0.008, r 2 = 0.86 one preparation, n = 3).


Resultados

Peroxisome fission is important for degradation

To analyze whether peroxisome fission is important for glucose-induced selective peroxisome degradation (macropexophagy), we analyzed this process in wild-type H. polymorpha as well as in two mutant strains (dnm1 y pex11) that are strongly impaired in peroxisome fission. 19 , 20 In line with earlier observations, the levels of the peroxisomal marker protein alcohol oxidase (AO) gradually decreased in the wild-type control upon induction of macropexophagy by glucose ( Fig.ꀚ and B ). However, in both dnm1 y pex11 cells, no significant reduction of AO protein levels was observed. A similar result was obtained in the atg11 control strain, which is defective in selective pexophagy. 21 These results suggest that a reduction in peroxisome fission affects glucose-induced macropexophagy.

Figureਁ. Reduced peroxisome degradation in H. polymorpha y S. cerevisiae fission mutants. (A) Pexophagy was induced by glucose in H. polymorpha cells grown for 20 h on methanol. Equal volumes of cultures were loaded per lane. Western blots decorated with anti-alcohol oxidase (α-AO) antibodies show no significant reduction in AO levels in the peroxisomal fission mutants dnm1 y pex11, similar to the atg11 control, which is blocked in pexophagy, whereas AO levels gradually decreased in the wild-type control as expected. (B) Densitometry quantification of the blots shown in (A). The amount of AO protein present at t = 0 h was set to 100%. The bar represents the standard error of the mean (SEM). (**p < 0.01). (C) Western blot analysis showing thiolase levels of S. cerevisiae cells grown on oleate and subsequently diluted into SD(-N) medium to induce peroxisome degradation. Samples were harvested at different time points, and equal amounts of protein were loaded per lane. There is no significant decrease of thiolase in the dnm1vps1∆ double mutant where the peroxisomal fission is completely blocked. A similar result was obtained for the atg1 control strain. In the wild-type and the single vps1 y dnm1 deletion strains degradation occurred. (D) Quantification of thiolase blots shown in (C). The level of thiolase protein at t = 0 h was set to 100%. Levels were adjusted to the loading control glucose-6-phosphate dehydrogenase (not shown). The bar represents the SEM (**p < 0.01). (mi) Constitutive peroxisome degradation is reduced in H. polymorpha fission mutants. Cells were grown on methanol for 16 h. Western blots were prepared using crude extracts and anti-GFP antibodies to detect Pmp47-GFP and GFP degradation products. The data show that the levels of the cleaved fusion protein (lower band) are reduced in pex11 y dnm1 cells, relative to the wild-type control. Equal concentrations of protein were loaded per lane. (F) Quantification of blots shown in (mi). The levels of full-length Pmp47-GFP proteins were arbitrarily set to 100%. The levels of cleaved GFP (lower band) are indicated as percentage of the full-length fusion protein. The bar represents the SEM (*p < 0.05 **p < 0.01).

To rule out that the observed block in pexophagy is not related to the fission defect in H. polymorpha dnm1 o pex11 cells, but related to a direct function of fission proteins in pexophagy, we performed a control study using Saccharomyces cerevisiae. Different from H. polymorpha, in baker’s yeast, Dnm1 and Vps1 have redundant functions in peroxisome fission. Consequently, single dnm1 y vps1 mutants are only partially affected in peroxisome fission and thus can be analyzed for a direct function of these proteins in pexophagy. 22 As shown in Figureꀜ and D , single S. cerevisiae dnm1 y vps1 mutants were not blocked in glucose-induced pexophagy, whereas cells of the dnm1 vps1 double mutant, which has a major peroxisome fission defect, were impaired in peroxisome degradation.

Usando un H. polymorpha strain that produces the peroxisomal membrane protein Pmp47 fused to green fluorescent protein (Pmp47-GFP), we analyzed constitutive peroxisome degradation in methanol-grown cells of H. polymorpha wild type and both dnm1 y pex11 mutant strains using western blot analysis and anti-GFP antibodies ( Fig.ꀞ ). As expected, in extracts of wild-type cells in addition to the band representing the full-length Pmp47-GFP fusion protein, a faster migrating band consisting of cleaved GFP was also evident, indicative of constitutive pexophagy. The ratio of the amount of cleaved GFP relative to the full-length fusion protein was reduced in dnm1 y pex11 cells compared with wild-type controls ( Fig.ꀟ ), indicating that constitutive autophagy of peroxisomes is also affected in H. polymorpha pex11 y dnm1 células. 23 Summarizing these data indicates that in yeast peroxisome fission is required for pexophagy.

Intra-peroxisomal protein aggregates affect growth and cause oxidative stress

Next, we addressed whether peroxisome fission acts in quality control of the organelles. For this we took advantage of earlier observations that production of a mutant variant of catalase, designated Cat mut , produced in wild-type H. polymorpha (i.e., also producing the endogenous catalase protein) forms enzymatically inactive protein aggregates in the peroxisomal lumen. 13 Peroxisomes containing these protein aggregates were used as a model for aberrant peroxisomes in this study.

First, we tested whether the presence of peroxisomal protein aggregates had physiological consequences. As shown in Figureꀪ cultures of the Cat mut strain showed a reduced yield. Remarkably, the specific catalase activities in cell extracts of cells of the Cat mut strain (185 U/mg) were enhanced relative to that of the wild-type control (130 U/mg). ROS measurements indicated that at all time points examined, the cells containing peroxisomal protein aggregates had enhanced ROS levels relative to the wild-type control ( Fig.ꀫ ).

Figureਂ. The effect of peroxisomal protein aggregates on growth and ROS levels. (A) Final optical densities of wild-type, dnm1 y pex11 cells, producing or not producing Cat mut , upon growth on methanol as sole carbon source for 40 h. Cell were extensively precultivated in glucose medium and subsequently shifted to medium containing methanol. Final optical densities are expressed as adsorption at 660 nm. The bar represents the SEM (*p < 0.05). (B) ROS levels in cells at different time points after the shift of glucose-grown cells to methanol medium. The mean intensity was measured by FACS. Cat mut cells show an enhanced ROS production relative to wild-type controls. The bar represents the SEM (*p < 0.05 **p < 0.01).

Intraperoxisomal protein aggregates are removed by fission and degradation

To substantiate whether the protein aggregates induce peroxisome fission, we introduced Cat mut in the H. polymorpha atg1 mutant, in which autophagic degradation of peroxisomes is blocked. 24 In order to visualize peroxisomes we introduced the fluorescent peroxisomal membrane marker Pmp47-GFP. Fluorescence microscopy analyses of cells, cultivated for 16 h on methanol, revealed that the Cat mut -producing atg1 strain contained, in addition to the normal organelles, relatively small organelles that were not observed in the atg1 parental strain ( Fig.ꀺ ). This result was confirmed by electron microscopy analysis of KMnO4-fixed cells ( Fig.ꀻ ) and also showed the presence of aggregates in the small organelles ( Fig.ꀻ ). Subsequent analysis, however, revealed that small organelles were not evident by fluorescence microscopy of wild-type cells producing Cat mut ( Fig.ꀺ ), whereas electron microscopy revealed that these cells harbored fewer small aggregate-containing peroxisomes relative to the atg1 strain producing Cat mut . Apparently, the small separated organelles were rapidly removed in the wild-type background. This process was further analyzed by electron microscopy. These analyses revealed that once formed, aggregates migrated to the periphery of the organelle where they were included in the buds that subsequently split off from the mother organelle ( Fig.ꀼ ).

Figureਃ. Microscopy analysis of H. polymorpha atg1, atg1-Cat mut and wild-type-Cat mut cells. Cells were grown on glycerol/methanol for 16 h. Peroxisomal membranes are marked by Pmp47-GFP. (A) Relative to the atg1 control, the atg1-Cat mut strain contains multiple small peroxisomes, which was not evident in wild-type-Cat mut cells. The bar represents 1 µm. The peroxisomal phenotype was confirmed by electron microscopy (B). Note the presence of protein aggregates in many of the organelles in atg1-Cat mut cells of which fewer are observed in wild-type-Cat mut cells. The bar represents 0.5 µm. (C) Ultrathin sections of KMnO4-fixed atg1-Cat mut cells showing different stages of the formation of a small peroxisome containing a protein aggregate. The bar represents 0.2 µm. (D) Electron micrographs, showing details of dnm1.atg1 cells (left panel) and pex11.atg1 cells (right panel) producing Cat mut , demonstrating the presence of aggregates in the enlarged peroxisomes in these cells. The bar represents 0.2 µm. P, peroxisomes M, mitochondria N, nucleus V, vacuole.

To further address their degradation, we cultivated the H. polymorpha Cat mut strain on a mixture of glycerol/methanol and subsequently administered 1 mM of the protease inhibitor phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) to the culture to reduce the rate of degradation of autophagic bodies in the vacuole. Electron microscopy analysis of these cells showed that at the onset of the experiment vacuoles in Cat mut -producing cells contained very low numbers of autophagic bodies ( Fig.ꁊ and B ). However, after 2 ( Fig.ꁌ and D ) and 4 h ( Fig.ꁎ and F ) of PMSF administration the accumulation of aggregate containing organelles in the vacuole was evident. These structures were not observed in the wild-type control. The presence of catalase protein was confirmed by immunocytochemistry ( Fig.਄G and H ). These data suggest that peroxisomes with protein aggregates are delivered to the vacuole for autophagic degradation. In conclusion, we showed that protein aggregates, which accumulated in the peroxisomal lumen are removed by concerted fission and degradation events.

Figure਄. Catalase aggregates are degraded by autophagy. H. polymorpha wild-type and Cat mut cells were cultivated on glycerol/methanol for 12 h and subsequently treated with 1 mM PMSF (t = 0). Electron micrographs of KMnO4-fixed Cat mut cells [at t = 0 h (B)], [at t = 2 h (D) and t = 4 h (F)] revealed progressive accumulation of autophagic bodies containing peroxisomes with protein aggregates that are not observed in wild-type cells (A, C and E). Immunocytochemical localization of catalase shows that labeling is confined to peroxisomes of wild-type cells (GRAMO) and is also abundant in the vacuole of Cat mut cells (H). M, mitochondria N, nucleus P, peroxisomes V, vacuole. The bar represents 0.5 µm.

Degradation of aggregates is reduced in dnm1, pex11 and atg11 células

Clearly, the separation of small aggregate-containing peroxisomes is different from the fission events that participate in normal peroxisome proliferation in wild-type cells. Therefore, we analyzed if this fission process depends on Dnm1 and Pex11. 19 , 20 To this end, corresponding deletion stains were constructed that produced Cat mut N-terminally fused to GFP (GFP-Cat mut ) to fluorescently mark the protein aggregates. Fluorescence microscopy analysis of cells also producing the DsRed-SKL peroxisomal matrix marker protein revealed that small green fluorescent spots were present in peroxisomes of both mutant strains, as well as in the wild-type control ( Fig.ਅ ). To analyze the possible presence of GFP-Cat mut in the vacuole, the red vacuolar marker FM 4� was used instead of DsRed-SKL ( Fig.ਆ ). Fluorescence microscopy analysis confirmed that green fluorescence was observed only infrequently in vacuoles of dnm1 y pex11 cells relative to the wild-type control ( Fig.ਆ ). Western blot analysis using crude extracts of these cells confirmed reduced cleavage of GFP-Cat mut relative to that in the wild-type cells producing GFP-Cat mut ( Fig.ਇ ). The reduced degradation of the aggregates also affected growth of the strains as lower growth yields on methanol were observed in both dnm1 y pex11 cells for the strains producing Cat mut ( Fig.ꀪ ).

Figureਅ. Visualization of catalase protein aggregates. H. polymorpha wild-type, dnm1 y pex11 cells, producing DsRed-SKL and GFP-Cat mut , were grown on methanol for 16 h. The peroxisomes contained GFP spots in the peroxisomal lumen, which represent the protein aggregates.

Figureਆ. Visualization of catalase protein aggregates. Identical experiment as shown in Figureਅ , using wild-type, dnm1 y pex11 cells, producing GFP-Cat mut stained with the vacuolar marker dye FM 4�. GFP fluorescence was frequently observed in the vacuoles of wild-type cells. GFP fluorescence was also observed in the vacuoles of the dnm1 y pex11 cells, albeit at reduced numbers compared with the wild-type control. The bar represents 1 µm.

Figureਇ. Autophagic degradation of GFP-Cat mut is reduced in pex11 y dnm1 células. (A) Western blot analysis using crude extracts of cells described in Figureਅ , decorated with anti-GFP antibodies. All strains contain both the full-length GFP-Cat mut protein together with GFP (arrow), due to cleavage of the fusion protein. Pyruvate carboxylase (Pyc1) was used as a loading control. (B) Quantification of the levels of GFP-Cat mut and GFP protein of the blots shown in (A). The level of full-length GFP-Cat mut is set to 100%. The bar represents the SEM (**p < 0.01). (C) Quantification of GFP fluorescence in the vacuole. The percentage of cells containing GFP fluorescence in the vacuole was calculated for wild-type, dnm1 y pex11 cells containing PAOXGFP-Cat mut . Per strain 2 samples of each 100 cells were counted The bar represents the SEM (*p < 0.05).

To strengthen the observation that Dnm1 and Pex11 are indeed required for the separation of the small aggregate-containing peroxisomes, we also performed electron microscopy analysis of dnm1 atg1 y pex11 atg1 double-mutant cells producing Cat mut . As evident from Figureꀽ , these cells harbor large peroxisomes that contain protein aggregates.

Degradation of the aggregates was also reduced upon deletion of ATG11, a gene involved in selective peroxisome degradation. En atg11 cells producing GFP-Cat mut numerous green spots were observed ( Fig.ꂊ ). However, vacuoles did not accumulate GFP as observed in the wild-type background (compare Fig.ਆ and Fig.ꂋ ). The block in autophagic degradation was furthermore evident from western blot analysis of these cells showing that cleavage of GFP from the GFP-Cat mut fusion protein was strongly reduced ( Fig.ꂌ ).

Figureਈ. Autophagic degradation of GFP-Cat mut is reduced in atg11 células. (A) En H. polymorpha atg11 cells producing DsRed-SKL and GFP-Cat mut and grown on methanol for 16 h, most GFP-Cat mut spots colocalize with the peroxisomal matrix marker DsRed-SKL. Some of the green spots do not colocalize with DsRed-SKL. Most likely this is the result of the asymmetric peroxisome fission process, resulting in the formation of small aggregate-containing peroxisomes that contain no or very little DsRed-SKL. (B) Vacuolar staining of atg11 GFP-Cat mut cells with FM 4� dye. GFP fluorescence in the vacuoles is reduced in atg11 cells relative to the wild-type control (see Fig.ਆ ). The bar represents 1 µm. (C) Western blots decorated with anti-GFP antibodies fail to demonstrate the GFP cleavage product (arrow) in atg11 cells producing GFP-Cat mut .


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The original ImageJ only supports image planes with 2 gigapixels (2^31 = 2147483648 pixels in case of a square image, the maximum allowed is 46340 x 46340 pixels) or less. If your data has extremely large image planes—e.g., 50000 x 50000 pixels—you may need to analyze region by region. One way to do this is using the “Crop on import” feature of the Bio-Formats plugin.

If you are using Bio-Formats to open a file, however, the size limit is a bit more complicated. Instead of using short[] as in ImageJ, Bio-Formats store data in byte[] when reading planes. If the source image is in 16 bit or in 32 bit (4 bytes, eg. floating point TIFF), the maximum pixel numbers allowed per plane will be 1/2 (1 gigapixels) or 1/4 (0.5 gigapixels), respectively.

ImageJ2 supports larger image planes internally, but uses the original ImageJ user interface by default, which once again limits visualization to 2 gigapixels. The ImageJ2 team is working to lift these size restrictions see imagej/imagej#87.


Métodos

Plant materials and growth conditions

Arabidopsis (Columbia-0) and the T-DNA insertion mutant line (SALK_056011, locus At4g17740) were obtained from the Arabidopsis Resource Center (Columbus, OH). Seedlings were grown on 1/2 MS medium containing 3.0% sucrose (pH 5.7) for 4 weeks under the conditions of 16 h light / 8 h dark cycle and 20 μmol photons m − 2 s − 1 light intensity during the light periods.

Blue native PAGE and 2D SDS-PAGE

Chloroplasts were extracted from 50 wild-type and 50 atctpa-mutant plants. Blue native gel electrophoresis was performed as described previously [25, 38]. For 2D SDS-PAGE, the blue native gel lanes were excised with a razor blade and incubated in 2 × SDS sample buffer containing 2.5% (vol / vol) β-mercaptoethanol (β-ME) for 20 min at 75 °C, then for 20 min at 25 °C. Lanes with denatured proteins were placed on top of 12% SDS gels, then subjected to the second dimensional separation.

Immunoblot analysis

For immunoblotting, protein samples were separated on 12% SDS gels and transferred to nitrocellulose membranes (BioTrace™ NT nitrocellulose, Mexico) followed by a western blot analysis. After blocking with 5% milk, the membranes were subsequently incubated with primary antibodies generated against the indicated proteins and detected using the Super Signal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate kit (Thermo Scientific, USA).

Yeast two-hybrid assay and growth curves analysis

The yeast two-hybrid assay was performed using the Split Ubiquitin System (DUAL membrane, Dualsystems Biotech) as described previously [39, 40]. The mature D1 (amino acids 1–344) and pD1 (amino acids 1–353) were cloned into pCCW-STE vector (encoding the Cub-LexA-VP16 fragment) as the bait for interaction assay. CP43, CP47 and D2 were cloned into pDSL-Nx vector (encoding the NubG fragment) as the prey for the assay. Yeast strain NMY32 was co-transformed with the bait and prey constructs, respectively. The interactions were determined by the growth of yeast cells on agar plates with Synthetic Defined (SD) medium lacking Trp, Leu, His, and adenine (SD-Trp Leu His Ade, FunGenome) without or with 2 mM 3-amino-1, 2, 4-Triazole (3-AT). The growth curves of liquid cultured yeast cells were obtained by measuring the absorbance at 600 nM (OD600). Six colonies of each transformation were cultured in SD-Trp Leu His Ade medium containing 30 μg / ml kanamycine. El OD600 values were recorded at various time points. pDSL-Nx vector was used as the negative control, and NubI was used as the positive control.

Análisis estadístico

ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) was employed to qualify the distribution ratio of PSII subunits among different subcomplexes.


Ver el vídeo: Analysing blots and gels with ImageJFiji (Noviembre 2022).