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Si una célula tiene dos GPCR diferentes, ¿cómo diferencia la célula entre la cascada de fosforilación causada por cada uno?

Si una célula tiene dos GPCR diferentes, ¿cómo diferencia la célula entre la cascada de fosforilación causada por cada uno?


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En mi curso de bioquímica, aprendimos que los receptores de GPCR desencadenan una cascada de fosforilación, y el resultado final es una gran amplificación de la señal en forma de cAMP. Nunca estudiamos ningún GPCR en particular de forma individual, pero se nos dijo que los GPCR siempre terminan en la formación de una gran cantidad de cAMP, que continuará fosforilando los objetivos clave que logran el resultado final.

Mi pregunta es la siguiente: si hay dos GPCR en la misma membrana celular (digamos GPCR-A y GPCR-B activados por los sustratos A y B respectivamente), ¿cómo "sabe" la célula qué GPCR activó la cascada de fosforilación si el El resultado final es el mismo (gran cantidad de AMPc). En teoría, ¿no podría el sustrato B unirse a GPCR-B y causar una cascada de fosforilación idéntica a la de GPCR-A, desencadenando así la respuesta celular de GPCR-A?

¿Existe alguna especialización / singularidad más profunda para cada tipo de receptor GPCR que no cubrimos en mi curso? ¿Cada GPCR produce una cascada ligeramente diferente que termina en algo similar, pero no exactamente cAMP? ¿O hay alguna restricción, como que cada celda se limite a un solo GPCR (me parecería sorprendente, si este es el caso)?


En primer lugar, sería una simplificación excesiva decir que los GPCR actúan solo a través de aumentos en el AMPc citosólico. Esto es cierto para los receptores acoplados a proteínas Gs, pero hay otras proteínas G como Gi, Go y Gq que actúan de manera diferente [1].

Ahora, una celda pueden tienen receptores acoplados a muchas proteínas G diferentes. El músculo liso vascular, por ejemplo, tiene receptores acoplados a Gs, Gi y Gq [2]. Además, una célula puede tener diferentes receptores que se acoplan a proteínas G del mismo tipo (p. Ej., Los hepatocitos tienen receptores de glucagón y beta adrenérgicos [3], que ambos se acoplan a G).

En tales situaciones, los efectos de diferentes hormonas se suman. El efecto final es una función de la total concentración citosólica del segundo mensajero (por ejemplo, cAMP). Por tanto, la degradación del glucógeno en un hepatocito depende de los efectos globales del glucagón y la epinefrina [3]. El hepatocito no tiene forma de "saber" qué molécula de AMPc fue formada por qué hormona.

Referencias

  1. https://en.wikipedia.org/wiki/Heterotrimeric_G_protein

  2. https://cvphysiology.com/Blood%20Pressure/BP026

  3. https://www.nature.com/articles/emm2015122


Capítulo cuatro - Modulación espacio-temporal de la activación de ERK por GPCR

ERK1 / 2 (proteína quinasas reguladas por señales extracelulares) son las proteínas nodales que regulan diversas funciones celulares principalmente en respuesta a la activación de las tirosina quinasas receptoras (RTK). ERK no solo se activa a través de una variedad de RTK, sino que la señalización no canónica a través de GPCR también los activa. Tal activación multimodal permite la integración apropiada de muchas entradas para decisiones críticas del destino celular, tales como la proliferación y diferenciación que las MAP quinasas regulan típicamente. Las MAP quinasas también regulan muchas respuestas polares como la apoptosis y la proliferación, la desdiferenciación-diferenciación y la diversidad en los resultados aunque la misma molécula terminal puede explicarse en función de las diferencias en la dinámica y las tasas de activación. Sin embargo, ahora se han establecido dos procesos como impulsores de la mayor parte de la diversidad registrada en los resultados de la señalización de MAP quinasa. Estos parámetros son la compartimentación celular, es decir, el confinamiento espacial de las moléculas que participan en una vía y los cambios en la cinética de la activación-desactivación, es decir, la regulación temporal. Si bien la fosforilación es la clave para activar las respuestas, específicamente para ERK, la MAP quinasa terminal, es la dinámica espacio-temporal la que gobierna el resultado generado por ella. Este capítulo revisa nuestra comprensión actual de la regulación espacial y temporal de la cascada de MAP quinasa y la actividad de ERK, específicamente a través de GPCR.


Artículo de MINI REVIEW

Xinming Wang 1,2, Abishek Iyer 3, A. Bruce Lyons 4, Heinrich K & # x000F6rner 1,5 & # x0002A & # x02020 y Wei Wei 1 & # x0002A & # x02020
  • 1 Laboratorio clave de medicina antiinflamatoria e inmunológica, Centro de innovación colaborativa de Anhui en medicina antiinflamatoria e inmunitaria, Instituto de Farmacología Clínica, Ministerio de Educación, Universidad Médica de Anhui, Hefei, China
  • 2 Departamento de Farmacia, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, China
  • 3 Instituto de Biociencia Molecular, Universidad de Queensland, Brisbane, QLD, Australia
  • 4 Facultad de Medicina, Universidad de Tasmania, Hobart, TAS, Australia
  • 5 Instituto Menzies de Investigación Médica, Universidad de Tasmania, Hobart, TAS, Australia

Los macrófagos han surgido como un componente clave del sistema inmunológico innato que emigra a los tejidos periféricos durante la gestación y en el organismo adulto. Su complejo camino hacia la madurez, su plasticidad única y sus diversas funciones como células efectoras y reguladoras durante una respuesta inmunitaria han sido objeto de una intensa investigación. Una clase de moléculas de superficie, los receptores acoplados a proteína G (GPCR) juegan un papel importante en muchos procesos inmunes. Han llamado la atención con respecto a estas funciones y el potencial de dianas terapéuticas que pueden modular la respuesta de las células inmunes en patologías como la diabetes, la aterosclerosis y las enfermedades inflamatorias crónicas. De los más de 800 GPCR identificados, & # x0007E100 actualmente están dirigidos a medicamentos cuya actividad se ha investigado en vivo. Los macrófagos expresan varios GPCR que tienen papeles centrales durante la diferenciación celular y en la regulación de sus funciones. Si bien algunos GPCR de macrófagos, como los receptores de quimiocinas, se han estudiado con gran detalle, aún no se comprenden bien las funciones de otros receptores de esta gran familia. Esta revisión resume los nuevos conocimientos sobre la biología de los macrófagos, las diferencias de los macrófagos humanos y de ratón y brinda detalles de algunos de los GPCR expresados ​​por este tipo de célula.


Conclusión

Está comprobado que las técnicas de fluorescencia son herramientas poderosas para la investigación de la familia muy dinámica de GPCR para comprender su localización subcelular y para dilucidar aún más los elementos clave en el tráfico de GPCR y la interacción con otras vías de señal.

Sin embargo, para obtener resultados fisiológicamente relevantes, se deben hacer algunas consideraciones. En primer lugar, es de suma importancia que el GPCR investigado, el ligando o la proteína de interacción no se vean influidos en su funcionalidad por la modificación fluorescente. Por lo tanto, se necesitan caracterizaciones cuidadosas y para excluir interferencias podría ser útil aplicar diferentes etiquetas en diferentes sitios de la proteína para la evaluación de los datos [212]. Además, la etiqueta debe ser lo más pequeña posible, el desarrollo reciente y en curso y la optimización de etiquetas autoetiquetado será ventajoso en este campo. Usando mutagénesis de aminoácidos no naturales, la incorporación específica del sitio de grupos ceto reactivos, como pag-benzoil-L-fenilalanina (Bzp) o pag-acetil-L-fenilalanina (Acp), en GPCR funcionales y su capacidad para reaccionar con una variedad de sondas espectroscópicas y de otro tipo se describió previamente [213]. Debido a sus excelentes propiedades fluorescentes, los puntos cuánticos son muy atractivos para el etiquetado, sin embargo, el potencial completo de las QD para la obtención de imágenes celulares aún no se ha realizado debido a problemas con el gran tamaño de QD, la multivalencia de QD y la dificultad de administrar QD en el citosol. Recientemente, se generaron puntos cuánticos monovalentes y de tamaño reducido y se aplicaron con éxito para la formación de imágenes de receptores en células vivas [214].

Los anticuerpos fluorescentes proporcionan una herramienta poderosa para examinar la distribución celular de los GPCR. Sin embargo, la cuantificación depende en gran medida de la accesibilidad, en la mayoría de los casos, del epítopo pequeño por el anticuerpo grande. El desafío consiste en desarrollar anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos o enzimas de alta afinidad para ensayos de marcaje de un solo paso en células vivas. La generación de tintes brillantes y estables, así como de tintes sensibles al pH, como CypHer 5 [34], permitirá conocer mejor la vida de los GPCR y permitirá aplicaciones de cribado de alto rendimiento. Un nuevo grupo de moléculas, llamadas moléculas affibody, es especialmente interesante para aplicaciones de imágenes debido a su pequeño tamaño (7 a 15 kDa) en comparación con los anticuerpos. Estas proteínas se componen de un paquete de tres hélices de 58 aminoácidos y se derivan del andamio de uno de los dominios de unión a IgG de la proteína A estafilocócica [215]. El sitio de unión es equivalente a un anticuerpo con respecto al área de superficie. El tamaño, la estructura simple, el reconocimiento específico de la diana, la facilidad de producción y la alta estabilidad dan a las moléculas de un cuerpo una ventaja significativa sobre los anticuerpos. Estas moléculas pueden marcarse con fluoróforos, pero también con radionúclidos, lo que las convierte en candidatas prometedoras para el diagnóstico y la terapia de tumores asociados a los GPCR [216].

Las tecnologías de ADN recombinante tienen un marcaje de fluorescencia muy avanzado, así como técnicas de transfección y transgénicas que permiten la entrega simple de ADN a las células, lo que da como resultado un marcaje covalente mediante el uso del sistema de expresión de proteínas de la célula. Sin embargo, los niveles de expresión en cultivos celulares pueden diferir significativamente de los de los sistemas naturales. Con respecto al comportamiento de señalización y tráfico de los GPCR, la relación entre la ocupación del receptor por los niveles fisiológicos de agonistas y el inicio de la translocación es un tema importante. El uso generalizado de concentraciones muy elevadas de agonista deja abierta la posibilidad de que los procesos investigados sean más farmacológicos que fisiológicos.

Una de las principales críticas de los estudios FRET / BRET utilizados para investigar las interacciones proteína-proteína es que la sobreexpresión de proteína requerida puede resultar en RET atribuido a una alta incidencia de colisiones aleatorias, en lugar de interacciones directas proteína-proteína. Si no se pueden obtener niveles de expresión bajos variando las cantidades de ADN dentro de las transfecciones celulares transitorias, las transfecciones celulares estables proporcionarán una alternativa, ya que existe una población homogénea de células que expresan la proteína de interés al mismo nivel. Otra posibilidad es el sistema de expresión de baculovirus, que permite controlar más estrechamente los niveles de expresión de proteínas que con la transfección transitoria, porque la expresión de proteínas puede titularse ajustando la multiplicidad de la infección viral [217].

Dado que la co-localización de proteínas es el primer requisito previo para las interacciones, esto debe demostrarse mediante microscopía de fluorescencia y mediante el uso de estrategias de marcaje paralelo para localizar subcelularmente la interacción de interés. Para una evaluación correcta de los datos de FRET y BRET, deben usarse controles apropiados para demostrar la especificidad de las interacciones y para establecer niveles de RET considerados como antecedentes en cualquier experimento dado. La aplicación adicional de un enfoque bioquímico podría respaldar los resultados. Validar el papel fisiológico de los estudios de interacción detectados en otros sistemas celulares más naturales, p. Ej. Las líneas celulares que expresan de forma endógena una proteína de interés, así como las investigaciones en tejidos y animales serán indispensables para demostrar la relevancia de las interacciones en el futuro. Por ejemplo, el en vivo La coexpresión de GPCR debe demostrarse en el mismo tejido, e idealmente en la misma célula, para establecer la relevancia fisiológica de la oligomerización del receptor. La intercomunicación funcional entre las vías de señalización del receptor, así como las propiedades farmacológicas y / o funcionales novedosas, proporcionarán pruebas del mecanismo por el cual las interacciones receptor-receptor modulan la actividad celular [218].

Una aplicación interesante de las quimeras GPCR-GFP implica su uso en cribados genéticos en organismos genéticamente tratables como la levadura, p. para identificar cepas de levadura mutantes en las que el receptor está mal localizado. Estas estrategias contribuyen en gran medida a la identificación de nuevos componentes implicados en la focalización y el tráfico de GPCR en organismos modelo adicionales [219]. Nuevos enfoques que utilizan organismos completos, en los que la quimera GFP se puede expresar bajo el control del promotor endógeno, p. invertebrados como C. elegans o modelos de ratón, permiten interpretar los resultados biológicos, moleculares y bioquímicos celulares en un contexto fisiológicamente relevante y compararlos con los observados en células cultivadas [220, 221]. GFP y sus variantes como reporteros representan el siguiente paso en la tecnología de ingeniería del genoma del ratón al abrir la posibilidad de uso combinatorio de reporteros no invasivos dentro de un solo animal, p. Ej. para la expresión génica, así como para la co-visualización y ensayos FRET [222].

En resumen, muchas cuestiones relativas a la vida de los GPCR se pueden abordar mediante técnicas de fluorescencia, sin embargo, muchas siguen siendo un desafío. Se pueden esperar más avances rápidos en la tecnología de etiquetado e imágenes y su aplicación paralela, así como su aplicación combinada, proporcionarán conocimientos novedosos que también ampliarán la gama de nuevas intervenciones terapéuticas.


Oligómeros de GPCR: ¿interacciones estáticas o dinámicas?

Los GPCR de la familia C, que incluyen los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR1-mGluR5), el receptor sensible al calcio (CaSR) y los receptores del ácido γ-aminobutírico (GABA)BR), entre otros, se diferencian de las otras familias de GPCR por grandes dominios extracelulares N-terminales bilobulados conocidos como dominios de atrapamoscas de venus (Pin et al., 2003 Pin et al., 2005). Estos receptores se asocian con ellos mismos y funcionan como dímeros constitutivos. En muchos casos, los dímeros del receptor se estabilizan mediante puentes disulfuro entre los residuos de Cys ubicados en los dominios del atrapamoscas venus (Romano et al., 1996 Ray et al., 1999 Ray y Hauschild, 2000). Sin embargo, la mayoría de los oliogómeros de los GPCR de clase A se forman a través de interacciones no covalentes, y los estudios recientes de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) apoyan la existencia de un equilibrio dinámico entre los estados de monómero y homodímero de los GPCR de clase A, como el receptor de dopamina D2 (D2R) y la β1-AR (Dorsch et al., 2009 Fonseca y Lambert, 2009). La dinámica de un dímero de GPCR de clase A se ha detallado con más detalle mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), revelando que

30% de acetilcolina M muscarínica recombinante1 receptor (M1R) expresados ​​en células CHO forman homodímeros transitorios con una vida útil tan corta como 0,5 segundos (Hern et al., 2010). Estos estudios sugieren que al menos algunos GPCR de clase A, como M1R, β1-AR y D2R, pueden asociarse transitoriamente entre sí, con vidas medias presumiblemente lo suficientemente largas como para permitir la activación de la proteína G.

Principio general del sistema de señalización GPCR. (A) Representación molecular de un GPCR en complejo con un Gαβγ, basada en estructuras cristalinas de rodopsina (coordenadas rojas del código PDB 1GZM) y la proteína Gi heterotrimérica inactiva (de PDB 1GG2). (B) Después de la unión del ligando, el receptor sufre cambios conformacionales que promueven el acoplamiento con proteínas G heterotriméricas (Gαβγ) y catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad α. Este evento desencadena eventos conformacionales y / o de disociación entre la subunidad α y la subunidad βγ. GαS activa las adenilil ciclasas, lo que conduce a la síntesis de cAMP, que a su vez activa la proteína quinasa A (PKA). Gαq activa la fosfolipasa C, que escinde el fosfatidilinositol (4,5) -bisfosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol (1,4,5) -trisfosfato (IP3). IP3 luego se difunde a través del citosol y activa la IP3-canales de Ca 2+ en las membranas del retículo endoplásmico, que provocan la liberación de Ca 2+ almacenado en el citosol. El aumento de Ca 2+ citosólico promueve la translocación de PKC a la membrana plasmática y luego la activación por DAG. Activación de GI bloquea la síntesis de AMPc mediada por adenilil ciclasa por sus subunidades α, mientras que los procesos de señalización mediados por Gβγ, como la activación de los canales de potasio rectificadores internos regulados por proteína G (GIRK). VSCC, canal de Ca 2+ sensible al voltaje.

Principio general del sistema de señalización GPCR. (A) Representación molecular de un GPCR en complejo con un Gαβγ, basada en estructuras cristalinas de rodopsina (coordenadas rojas del código PDB 1GZM) y la proteína Gi heterotrimérica inactiva (de PDB 1GG2). (B) Después de la unión del ligando, el receptor sufre cambios conformacionales que promueven el acoplamiento con proteínas G heterotriméricas (Gαβγ) y catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad α. Este evento desencadena eventos conformacionales y / o de disociación entre la subunidad α y la subunidad βγ. GαS activa las adenilil ciclasas, lo que conduce a la síntesis de cAMP, que a su vez activa la proteína quinasa A (PKA). Gαq activa la fosfolipasa C, que escinde el fosfatidilinositol (4,5) -bisfosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol (1,4,5) -trisfosfato (IP3). IP3 luego se difunde a través del citosol y activa la IP3Canales de Ca 2+ activados en las membranas del retículo endoplásmico, que provocan la liberación de Ca 2+ almacenado en el citosol. El aumento de Ca 2+ citosólico promueve la translocación de PKC a la membrana plasmática y luego la activación por DAG. Activación de GI bloquea la síntesis de AMPc mediada por adenilil ciclasa por sus subunidades α, mientras que los procesos de señalización mediados por Gβγ, como la activación de los canales de potasio rectificadores internos regulados por proteína G (GIRK). VSCC, canal de Ca 2+ sensible al voltaje.

Modulación de la señalización celular mediante conmutadores interconformacionales rápidos.

Durante la última década, estudios recientemente revisados ​​por Rozenfeld y Devi (Rozenfeld y Devi, 2010) revelaron que la heterodimerización del receptor modula las propiedades farmacológicas, de señalización y tráfico de los receptores parentales individuales. Ejemplos de aspectos tan fascinantes de la heteromerización del receptor se encuentran en las diferentes combinaciones entre los receptores gustativos T1R1, TIR2 y TIR3, que modulan la sensibilidad de las moléculas gustativas: el heterodímero T1R1-T1R3 media el sabor umami del glutamato, mientras que el heterodímero T1R2-T1R3 media el sabor dulce (Nelson et al., 2001 Zhao et al., 2003 Mueller et al., 2005). Heterodímeros del receptor entre la adenosina A2A y dopamina D2 receptores es otro ejemplo atractivo de cómo la heterodimerización del receptor puede modular la función del receptor.Este dímero receptor se expresa en neuronas GABAérgicas estriatopalidales que están presentes en los ganglios basales, una región del cerebro que participa en la integración sensorial-motora (Canals et al., 2003). La adenosina inhibe la actividad locomotora inducida por la dopamina y, al ejercer efectos opuestos en los ganglios basales, la A2A-D2 El heterómero receptor contribuye al ajuste fino de la actividad neuronal. A nivel bioquímico, la activación de A2A receptores por adenosina o análogos de adenosina afecta la farmacología de D2 receptores modulando las características de unión de los agonistas de la dopamina y contrarresta la D2-Respuestas intracelulares mediadas por receptores (Agnati et al., 2003). La unión del ligando a un receptor que altera la activación del receptor asociado en el complejo heterodímero llevó a la hipótesis de que los cambios conformacionales inducidos por la unión del ligando a un receptor podrían transmitirse al receptor asociado para modular su función (Zoli et al., 1993 ).

Cinética de reacciones tempranas en la cascada de señalización de GPCR. Constantes de tiempo (τ) de (A) asociación de ligando (L), (B) activación del receptor (R) (R *), (C) asociación receptor-proteína G, y (D) La activación de la proteína G (G) (G *) se muestra para dos sistemas GPCR distintos: el receptor de la hormona paratiroidea (PTHR) en respuesta al principal regulador endocrino de la homeostasis del Ca 2+, PTH y α2A-AR en respuesta al principal neurotransmisor de los nervios simpáticos, la noradrenalina.

Cinética de reacciones tempranas en la cascada de señalización de GPCR. Constantes de tiempo (τ) de (A) asociación de ligando (L), (B) activación del receptor (R) (R *), (C) asociación receptor-proteína G, y (D) La activación de la proteína G (G) (G *) se muestra para dos sistemas GPCR distintos: el receptor de la hormona paratiroidea (PTHR) en respuesta al principal regulador endocrino de la homeostasis del Ca 2+, PTH y α2A-AR en respuesta al principal neurotransmisor de los nervios simpáticos, la noradrenalina.

Modulación de la señalización de la proteína G por heterodímeros del receptor. Representación de la α2A-AR (rojo) -MOR (azul) complejo heterodímero basado en la estructura cristalina de la rodopsina (coordenadas del código PDB 1GZM) y las estructuras químicas de la noradrenalina y la morfina. La señalización de la proteína G mediada por el heterodímero del receptor en respuesta a la noradrenalina o la morfina está modulada por la acción simultánea de ambos ligandos de señalización. Esta modulación procede a través de cambios conformacionales (flechas) que se propagan de un receptor a otro con una vida media de 400 msegundos.

Modulación de la señalización de la proteína G por heterodímeros del receptor. Representación de la α2A-AR (rojo) -MOR (azul) complejo heterodímero basado en la estructura cristalina de la rodopsina (coordenadas del código PDB 1GZM) y las estructuras químicas de la norepinefrina y la morfina. La señalización de la proteína G mediada por el heterodímero del receptor en respuesta a la noradrenalina o la morfina está modulada por la acción simultánea de ambos ligandos de señalización. Esta modulación procede a través de cambios conformacionales (flechas) que se propagan de un receptor a otro con una vida media de 400 msegundos.

Confirmamos esta hipótesis con estudios FRET en células vivas, al mostrar que las interacciones alostéricas entre el α2A-AR y el receptor μ-opioide (MOR) están mediados por cambios directos de conformación cruzada entre estos receptores (Vilardaga et al., 2008). Noradrenalina y morfina, que son los ligandos nativos de la α2A-AR y MOR, respectivamente, son bien conocidos por estimular la proteína G inhibitoria común (GI) vías de señalización mediadas a través de sus respectivos receptores, pero la acción simultánea de la noradrenalina y la morfina produce una respuesta celular diferente de los efectos aditivos esperados (Jordan et al., 2003). En este caso, la unión de la morfina al MOR desencadena un cambio conformacional rápido en el α unido a la norepinefrina (NE)2A-AR que procede con un t1/2= 400 msegundos, que es más rápido que la cinética para la activación de la proteína G (Fig. 3). Este rápido cambio transconformacional entre receptores disminuye tanto la activación de GI señalización y estimulación de la fosforilación de MAP quinasa. Un interruptor transconformacional en la dirección inversa, desde el α2A-AR hacia el MOR, no se observó directamente porque los biosensores MOR basados ​​en FRET no son funcionales. Sin embargo, la inhibición de la activación de la proteína G mediada por morfina por NE sugiere que también se produce dicha transferencia conformacional. Por tanto, la diafonía conformacional entre receptores es bidireccional y previene rápidamente la sobreestimulación de las vías de señalización mediante una combinación de ligandos que actúan sobre un heterómero del receptor, ajustando rápidamente el grado de activación de la proteína G.

Una propiedad fundamental de los ligandos que actúan en un GPCR dado es su capacidad para estabilizar diferentes conformaciones de receptores activos, cada una de las cuales puede activar una vía de señalización única. El término "selectividad funcional" se introdujo como un parámetro para expresar la capacidad de un ligando para producir una respuesta selectiva (Kenakin y Miller, 2010). La selectividad funcional en el agonismo también está relacionada con el heterodímero de GPCR. Por ejemplo, el GI-receptor cannabinoide acoplado (CB1R) forma un complejo heterodimérico con el GS-acoplado A2AR y señales a GI solo cuando CB1 y A2A los agonistas se combinan (Carriba et al., 2007). Estos hallazgos sugieren que la interacción receptor-receptor limita la capacidad del CB1R para adoptar una conformación activa que pueda estimular GI activación en el CB1I + D2R heterodímero, y que esta restricción se libera solo por la acción de un A2A agonista. Esta liberación podría lograrse mediante conmutadores interconformacionales entre estos dos receptores. Esta hipótesis necesita ser probada, pero indicaría que la selectividad funcional en los heterómeros de GPCR se modula directamente al nivel de los receptores a través de la diafonía conformacional.


Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) desempeñan un papel integral en la transducción de señales de una enorme variedad de fenómenos biológicos, por lo que sirven para modular a nivel molecular casi todos los componentes de la biología humana. Este papel no es más evidente en ninguna parte que en la biología cardiovascular, donde los GPCR regulan medidas centrales de la función cardiovascular como la frecuencia cardíaca, la contractilidad y el tono vascular. La interacción GPCR / ligando inicia cascadas de transducción de señales y requiere la presencia del receptor en la membrana plasmática. La localización de la membrana plasmática es a su vez una función de la entrega de un receptor y su eliminación de la superficie celular, un concepto definido más ampliamente como tráfico de receptores. Esta revisión ilumina nuestra visión actual del tráfico de GPCR, particularmente dentro del sistema cardiovascular, y también destaca el hallazgo reciente y provocador de que los componentes de la maquinaria de tráfico de GPCR pueden facilitar la señalización de GPCR independientemente de la activación de la proteína G.

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) son mediadores centrales de casi todos los aspectos de la biología cardiovascular. Los GPCR se identificaron originalmente como receptores capaces de acoplarse a proteínas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) específicas, transduciendo así una señal extracelular a un efector intracelular, aunque más recientemente, se ha demostrado que varios GPCR emiten señales a través de mecanismos independientes de la proteína G tanto en vitro e in vivo. 1 Como familia de proteínas, los GPCR comparten características estructurales comunes, incluidos siete dominios que atraviesan la membrana y, por lo tanto, se denominan alternativamente receptores 7-transmembrana. Los GPCR son la superfamilia más grande de receptores de superficie celular y representan aproximadamente el 2% del genoma humano. 2 Además, los ligandos dirigidos a los GPCR (principalmente agonistas y antagonistas) representan la familia más grande de agentes farmacológicos, y representan casi el 30% de los agentes farmacéuticos clínicos disponibles actualmente. 3 Tanto las hormonas como los neurotransmisores ejercen sus efectos sobre el sistema cardiovascular a través de los GPCR. Ejemplos de GPCR con funciones bien atribuidas en biología cardiovascular incluyen la β1- y β2-receptores adrenérgicos (AR), el α1- y α2-ARs, la M2- y M3-receptores de acetilcolina muscarínicos, los receptores de angiotensina II (Ang II), los receptores de endotelina, el receptor de adenosina, el receptor de trombina y el receptor de vasopresina.

Durante las últimas casi 3 décadas, una gran cantidad de información ha revelado mucho sobre las propiedades de señalización de esta familia de siete receptores que atraviesan la membrana. Gran parte del trabajo se ha centrado en revelar las formas en que los GPCR regulan moléculas efectoras discretas, incluidas la adenilil ciclasa, las fosfolipasas y los canales iónicos. Aún más trabajos han arrojado luz sobre los mecanismos por los cuales se regula la señalización de GPCR y han conducido al descubrimiento de proteínas adicionales, incluidas las proteínas GPCR quinasas (GRK) 4,5 y β-arrestina, 6,7 que fosforilan respectivamente los GPCR activados por agonistas y se unen a los GPCR fosforilados para interrumpir físicamente la interacción entre el receptor y la proteína G, lo que conduce a la desensibilización de la activación de la proteína G mediada por el receptor. Además de su papel en la desensibilización de GPCR, la unión de la β-arrestina también promueve la translocación del citosol a la superficie celular de los componentes de la maquinaria endocítica, a saber, la proteína adaptadora 2 (AP-2) 8 y la clatrina, lo que facilita la eliminación del receptor del plasma. membrana.

Aunque todavía es sustancial, comparativamente menos trabajo se ha centrado en el tráfico de GPCR, gran parte de él relacionado con los mecanismos que regulan la endocitosis de los GPCR de la superficie celular, incluido el papel de la β-arrestina en la facilitación de la endocitosis de GPCR como se indicó anteriormente. De hecho, el suministro apropiado de GPCR a la superficie celular para permitir interacciones receptor / ligando, y su posterior recuperación de la membrana plasmática, son de fundamental importancia para la regulación de la actividad de GPCR. Esta revisión destaca nuestra comprensión actual del movimiento de GPCR desde la síntesis en adelante, con especial énfasis en los estudios de GPCR del sistema cardiovascular. Por último, discutimos la importancia del papel recientemente reconocido que el propio tráfico de GPCR puede tener en la señalización celular, incluido el papel recientemente reconocido y en expansión de las β-arrestinas en la señalización de GPCR independientemente de las proteínas G.

Tráfico de GPCR: postraducción

Tanto durante la síntesis como después de la misma, las proteínas de membrana, incluidos los GPCR, experimentan un proceso continuo de maduración antes de alcanzar su residencia en la membrana plasmática. Deben insertarse correctamente en la membrana (un proceso que se cree que ocurre de manera cotraduccional para la mayoría de las proteínas de membrana), lograr un plegado adecuado mientras aún residen en el retículo endoplásmico, atravesando el cis- al trans-Golgi mientras se someten a modificaciones, y finalmente se dirigen a la membrana plasmática donde alcanzan su residencia como proteínas maduras. Esta sección discutirá varios aspectos de este proceso de maduración que se han determinado para los GPCR (Figura, A).

Modelo general de tráfico de GPCR. A, Después de la síntesis, los GPCR residen inicialmente en el RE, donde se procesan y se pliegan guiados por proteínas acompañantes y de control de calidad. Dentro del RE, es probable que muchos GPCR formen estructuras homo o heterodiméricas. Después de la salida del ER, los GPCR transitan a través del aparato de Golgi, donde pueden sufrir modificaciones adicionales, como el procesamiento de oligosacáridos. En el borde distal del aparato de Golgi, los GPCR se empaquetan en vesículas de transporte exocítico y entran al sistema endosómico, donde posteriormente se dirigen a la membrana plasmática. Se han identificado múltiples proteínas, como se enumera, que afectan la estabilidad de GPCR en la superficie celular. ERAD indica degradación asociada a ER. B, Aunque se han descrito variaciones, la endocitosis por GPCR de la membrana plasmática ocurre con mayor frecuencia de una manera dependiente de GRK y β-arrestina. La unión del ligando promueve la fosforilación mediada por GRK de la superficie citoplásmica de GPCR y la posterior translocación de β-arrestina y la unión al receptor. La unión de β-arrestina, a su vez, facilita el reclutamiento posterior de AP-2 y la inclusión de clatrina y GPCR en CCP antes de la endocitosis a través de CCV. C. Después de la endocitosis, los GPCR pueden reciclarse a la membrana plasmática o clasificarse para la degradación lisosomal. La familia Rab de pequeñas GTPasas es integral para determinar el destino de un GPCR, mientras que se ha demostrado más recientemente que SNX1 desempeña un papel en la clasificación de GPCR endosomal a lisosomal. La ubiquitinación del receptor también juega un papel en la degradación del receptor a través de los lisosomas. D, Más recientemente, se ha demostrado que varios GPCR son capaces de señalizar a través de vías dependientes de β-arrestina. Cascadas de señalización dependientes de β-arrestina bien caracterizadas que se han descrito incluyen la activación de tirosina quinasa no receptora dependiente de agonistas, así como la activación de la vía de señalización MAPK.

Plegables y acompañantes

Los estrictos mecanismos de control de calidad dentro de las células aseguran que las proteínas plegadas de manera incorrecta o incompleta sean el objetivo de la degradación, generalmente a través de la vía del proteasoma. Para la mayoría de las proteínas nacientes estudiadas, el plegamiento en una conformación adecuada / funcional requiere la presencia de proteínas acompañantes endógenas accesorias. Los 10 GPCR no son una excepción a este proceso de control de calidad. Como ejemplo, la proteína DnaJ humana HSJ1b, un miembro de la familia de las cochaperonas citoplasmáticas de la proteína de choque térmico (HSP), regula el tráfico de rodopsina desde el retículo endoplásmico (ER) a la superficie celular. 11 Alternativamente, las proteínas chaperonas que atraviesan una sola membrana pueden facilitar la salida de GPCR del RE, como se demostró recientemente para el receptor similar al receptor de calcitonina, que debe formar un complejo heterodimérico con la proteína modificadora de la actividad del receptor (RAMP) antes de la salida del RE (revisado por Tan et al 12). Actualmente se desconoce si estas o proteínas acompañantes endógenas similares regulan el plegamiento de los GPCR importantes para algunos aspectos de la biología cardiovascular, pero ciertamente es posible dada la conservación estructural en esta gran familia de proteínas.

Sin embargo, a pesar de tales controles para garantizar que se produzcan errores de plegamiento de proteínas adecuados. Como tal, se han identificado una variedad de enfermedades humanas en las que las mutaciones que ocurren naturalmente dan como resultado el plegamiento incorrecto y / o la orientación errónea de una proteína mutante. Por tanto, se considera que tales enfermedades "conformacionales de proteínas" son el resultado de mutaciones que no afectan al dominio o dominios funcionales de la proteína mutante, sino que interfieren con el tráfico celular normal de la proteína (revisado por Bernier et al 13). Tales proteínas mal plegadas típicamente forman agregados que son perjudiciales para la célula o se reconocen como plegadas incorrectamente y, por lo tanto, se dirigen a la degradación por los mecanismos de control de calidad celular mencionados anteriormente (revisado por Sitia y Braakman 14). Curiosamente, trabajos recientes han demostrado que, en algunos casos, la manipulación química o farmacológica puede rescatar proteínas mal plegadas y conducir a su correcta translocación a la membrana plasmática donde las proteínas son funcionalmente activas.

La diabetes insípida nefrogénica (NDI) es un trastorno ligado al cromosoma X 15 con una incidencia en la población de aproximadamente 1 por 250 000. La NDI se caracteriza por la resistencia renal a la hormona antidiurética derivada de la hipófisis posterior (también llamada vasopresina arginina), un octapéptido que normalmente actúa en el receptor de vasopresina 2 (V2R) presente en las células epiteliales renales para permitir una concentración urinaria normal. 15 En pacientes con NDI y la ausencia completa de epitelio renal V2Expresión de la superficie de las células R, el volumen urinario diario puede superar los 15 L y provocar una muerte rápida. Más de 150 mutaciones diferentes en la V2Se han descrito R, la mayoría de los cuales (≈70%) deterioran V2Tráfico de superficie de células R (revisado por Bernier et al 13). La adición de una V permeable a las células2R antagonista de un subconjunto del mutante V2Las R que se habían demostrado previamente que se acumulaban en el RE dieron como resultado el plegamiento adecuado, la salida del RE, la orientación correcta a la superficie celular y el rescate funcional de la actividad del receptor de las proteínas mutantes. 16 Esto es presumiblemente atribuible a la capacidad del ligando de molécula pequeña para estabilizar el estado nativo de la proteína, facilitando así el tráfico adecuado del receptor. Los receptores 7-transmembrana mutantes adicionales que se sabe que tienen propiedades de tráfico alteradas que resultan en enfermedades humanas, y para los cuales se han identificado chaperonas moleculares, incluyen la rodopsina, el receptor 1 de sulfonilurea (SUR1), suavizado y el receptor de la hormona liberadora de gonadotropina (revisado por Bernier y col. 13). Sin embargo, queda por ver si el tratamiento farmacológico de las dianas de receptores mal traficadas identificadas anteriormente en los sistemas celulares se traducirá en una mejora de la enfermedad humana.

Oligomerización

Los primeros estudios que utilizaron los receptores de rodopsina 17,18 muscarínicos 19 y β-adrenérgicos 20 como modelo de GPCR sugirieron que los GPCR existen principalmente como monómeros, aunque la modificación de los sistemas de extracción de detergente utilizados para la purificación de proteínas llevó a los primeros investigadores a sugerir que una fracción variable de los GPCR también puede estar presente en forma oligomérica. 19,20 Muchos trabajos recientes que utilizan técnicas de transferencia de energía por coinmunoprecipitación y resonancia han demostrado de manera convincente que las estructuras diméricas de GPCR están presentes en la membrana plasmática y son el tema de varias revisiones recientes. 21-24 De hecho, se ha postulado que los GPCR homo y heterodiméricos pueden representar la unidad funcional básica necesaria para la mayoría, si no todas, las señales de GPCR (revisado por Park et al 25). Sin embargo, no se ha demostrado claramente si pueden formarse complejos oligoméricos de orden superior en la membrana plasmática, aunque el M2Se ha sugerido que el receptor -muscarínico es capaz de formar un trímero. 26

Sin embargo, no se aprecia ni se comprende bien el papel probablemente importante que desempeña la oligomerización de los GPCR en la biosíntesis y el tráfico de los GPCR nacientes a la superficie celular. De hecho, múltiples GPCR, incluido el β2-AR 27 y los receptores 28 de vasopresina experimentan una homodimerización constitutiva al principio de la vía biosintética, que probablemente ocurre en el RE. Expresión de β mutante2-Los AR construidos para carecer de un motivo de exportación de ER o para contener una señal de retención de ER heteróloga condujeron al atrapamiento de β de tipo salvaje2-AR en el ER, probablemente debido a la dimerización del receptor. 27 Es importante destacar que la adición de un péptido correspondiente al supuesto motivo de dimerización similar a la glicoforina en el sexto dominio transmembrana del β2-AR inhibió tanto la dimerización del receptor como el tránsito a la superficie celular. 29 Resultados similares en los que mutantes de la V2R 30 o la D2 Los receptores 31 de dopamina actúan como negativos dominantes para la expresión en la membrana plasmática de sus respectivos receptores de tipo salvaje, lo que sugiere que la oligomerización del receptor antes de la entrega a la superficie celular puede ser un mecanismo general por el cual se regulan múltiples miembros de la familia GPCR.

Además de la homodimerización, la heterodimerización temprana también juega un papel importante en el direccionamiento adecuado de algunos GPCR, como se demostró recientemente para el α1D-AR, que requirió heterodimerización con el α estrechamente relacionado1B-AR para la expresión de la superficie celular. 32 Estudios de inmunoprecipitación en los que β marcado con epítopo2-AR y Ang II tipo 1 (AT1) receptores (AT1Rs) se coexpresaron sugiriendo que los receptores pueden formar oligómeros antes de su localización en la membrana plasmática, ya que la cantidad de complejo receptor inmunoprecipitado no se vio afectada por la exposición a agonistas o antagonistas. 33 Estudios adicionales han demostrado el hallazgo inesperado de que la heterodimerización entre el β2-AR y un receptor olfatorio 34 o el α1D-AR 35 facilita la exportación de ER del receptor y la expresión en la superficie celular. Finalmente, expresión de la β2-AR junto con los receptores opioides δ y κ en células cultivadas conduce a la heterooligomerización de la β2-AR con el receptor opioide δ o κ en la membrana plasmática. 36 Curiosamente, esta asociación no afectó la unión del ligando o las propiedades funcionales de los receptores, pero sí alteró las propiedades de tráfico. En el δ-β2 células, los receptores δ se sometieron a β2-Internalización estimulada por agonistas AR y β2-AR sufrió endocitosis mediada por opioides, mientras que en κ-β2-Células AR, las β2-AR no se internalizó en respuesta a β2-Agonista AR u opioide. 36 Aunque este es un solo ejemplo, estos resultados sugieren que la heterooligomerización de GPCR puede ser una forma importante de modular el tráfico y la señalización de GPCR. Sin embargo, es importante señalar que en cada estudio de oligomerización descrito anteriormente, se realizó una sobreexpresión del receptor o receptores de interés y que tales alteraciones en el contenido del receptor celular pueden modificar las interacciones moleculares endógenas que ocurren en ausencia de sobreexpresión del receptor.

Por lo tanto, además del papel importante que desempeñan las chaperonas moleculares endógenas, como las proteínas de la familia HSP y RAMP, en el plegamiento de proteínas y la exportación ER de GPCR, es probable que la oligomerización de homo y heterorreceptores también desempeñe un paso crítico en la vía utilizada por al menos algunos GPCR. para el tráfico celular, aunque en la actualidad no está claro si la oligomerización después de la síntesis de proteínas es una vía general utilizada por todos los GPCR.

Estabilidad de la superficie celular

Para que un GPCR transduzca una señal extracelular, debe transitar correctamente y ser retenido en la superficie celular para permitir la interacción receptor / ligando. Se han identificado múltiples proteínas que no participan directamente en la cascada de transducción de señales que estabilizan la expresión de la superficie del receptor. Estos incluyen espinofilina, Homer, proteína de unión a actina 280 / filamina A, proteína 4.1N, muskelina y densidad postsináptica 95 (PSD-95) (revisado por Tan et al 12). De estos, PSD-95, una proteína de andamiaje que contiene múltiples dominios PDZ, ha demostrado de manera más concluyente que interactúa específicamente con un GPCR fundamental para la biología cardiovascular, a saber, el β1-ARKANSAS. Esta interacción ocurre a través del tercer dominio PDZ de PSD-95, que interactúa con el terminal carboxilo de la β.1-ARKANSAS. Curiosamente, la sobreexpresión de PSD-95 disminuyó la β1-AR internalización, pero no afectó la producción de cAMP estimulada por agonistas o la desensibilización del receptor, lo que sugiere un papel para PSD-95 en el mantenimiento de la β1-AR en la superficie celular. 37

Tráfico de GPCR: endocitosis

Mucho trabajo durante las últimas décadas ha iluminado nuestra comprensión actual de los mecanismos moleculares que subyacen a la eliminación de GPCR de la superficie celular. Fundamentales para este proceso son 2 familias de proteínas, las quinasas GPCR (GRK) y las arrestinas β, las cuales fueron identificadas inicialmente en estudios de desensibilización de GPCR y que están involucradas en la eliminación de GPCR activados por ligandos de la membrana plasmática. El trabajo adicional ha identificado un conjunto de proteínas accesorias, que interactúan con las clases de proteínas GRK y β-arrestina, y se han dedicado muchos esfuerzos recientes a delinear los detalles de estas múltiples interacciones que son inherentes al proceso de endocitosis de GPCR. Además, como se describirá a continuación, la ubiquitinación postraduccional inducida por agonistas tanto del receptor como de la β-arrestina desempeña papeles definitivos y discretos en la regulación del ciclo de vida de los GPCR (Figura, B).

Papel del microambiente lipídico en el tráfico de GPCR

La comprensión de la importancia del microambiente de lípidos de membrana para la señalización y el tráfico de GPCR está evolucionando rápidamente. Como ejemplo, recientemente se ha demostrado que tras la traducción, el AT1R requiere caveolina como acompañante molecular intracelular para el tráfico a la membrana plasmática. 38 Además, una vez en la superficie celular, está claro que algunos subconjuntos de GPCR se segregan preferentemente en regiones discretas de la membrana definidas como balsas lipídicas. 39-41 Los GPCR de importancia fundamental para la biología cardiovascular que se han localizado en balsas lipídicas y / o caveolas incluyen la adenosina A1, α1-AR, β1-AR, β2-UNA RATA1R, los receptores de endotelina (ETA-A y ET-B) y el M2-receptores muscarínicos. 42

Caveolae, un tipo específico de microdominio lipídico, representa para algunos GPCR el microambiente preferido para ciertos eventos como la señalización. Sin embargo, el mantenimiento de un receptor dentro de un microambiente específico puede estar sujeto a una regulación dinámica. De hecho, se han descrito modificaciones de GPCR reversibles, que incluyen tanto la unión covalente de un lípido al GPCR como la fosforilación de GPCR, que pueden desplazar el GPCR entre diferentes medios de membrana. Por ejemplo, se ha demostrado que una modificación lipídica reversible (p. Ej., Palmitoilación / despalmitoilación de residuos de cisteína) se dirige a los GPCR como el 5-HT1a receptor de balsas lipídicas. 43 Curiosamente, la endocitosis del β inducida por agonistas1-AR a través de hoyos recubiertos de clatrina (CCP) en células 293 de riñón embrionario humano (HEK) requiere la fosforilación de GRK del receptor, mientras que la endocitosis del β1-AR en balsas lipídicas / caveolas depende del receptor que se somete a la fosforilación de la proteína quinasa A. 44 Otra evidencia que apoya la importancia de la restricción del microdominio de la membrana de GPCR es que el confinamiento de la β2Se ha informado que la AR a caveolas es de importancia crítica para la regulación de la tasa de contracción intrínseca en preparaciones de membranas de miocitos cardíacos neonatales. 45 La importancia del microambiente de lípidos para el ensamblaje de andamios de señalización debajo de la interfaz GPCR / membrana también es un área de investigación activa y puede desempeñar un papel en múltiples aspectos del tráfico de GPCR, pero está más allá del alcance de esta revisión. Para una revisión más completa del papel del microambiente de lípidos en la señalización y el tráfico de GPCR, consulte varias revisiones excelentes recientes. 39,42

Internalización de GPCR dependiente de agonista versus independiente de agonista

La internalización del receptor después de la exposición a un agonista es una respuesta bien documentada para una amplia variedad de GPCR importantes para la biología cardiovascular. Como ejemplo, el GPCR prototípico, el β2-AR, se demostró inicialmente que se internaliza después de la exposición a un agonista, como se demuestra por la pérdida de unión a la superficie de un ligando de membrana no permeable. 46 Sin embargo, el uso de un ligando que permea la membrana demostró que la β2-AR todavía era accesible por ligando, lo que sugiere que el receptor estaba secuestrado en un compartimento intracelular después del tratamiento con agonista. 46 Alternativamente, mientras que la exposición del TA1R a Ang II conduce a la internalización del receptor y al secuestro endosómico, el receptor de Ang II tipo 2 (AT2R) no sufre endocitosis con la adición de Ang II, lo que demuestra que la clasificación e internalización de receptores específicos de subtipo puede ocurrir dentro del sistema cardiovascular GPCR. 47

La internalización de la mayoría de los GPCR se produce en el orden de minutos y se correlaciona con la fosforilación del receptor por parte de los GRK y la posterior translocación de β-arrestina, como se discutirá más adelante. De hecho, la β inducida por agonistas2La internalización del receptor -AR puede inhibirse por mutaciones del β2-AR, que inhiben la fosforilación de GRK inducida por agonistas 48 o por mutaciones en las proteínas β-arrestina. 49 Después de la internalización, los receptores pueden reciclarse a la superficie celular o dirigirse a la degradación lisosomal (revisado por Bohm et al 50).

También se ha examinado la internalización de GPCR en ausencia de agonista. Aunque las velocidades medias de internalización varían entre los receptores ensayados, las velocidades en general se reducen sustancialmente en ausencia en relación con la presencia del ligando análogo de un GPCR. El β2-AR, por ejemplo, sufre un secuestro de la superficie celular con una vida media de aproximadamente 10 minutos en presencia de agonista pero permanece en la superficie celular durante más de 1 hora en ausencia de agonista. 51

El papel de las proteínas accesorias en la endocitosis de los GPCR

La endocitosis de los GPCR puede ocurrir a través de caveolas, vesículas recubiertas de clatrina o vesículas no recubiertas. 52 Aunque los tramos lineales cortos de aminoácidos en los dominios citoplásmicos de los GPCR probablemente juegan un papel en su endocitosis, la mayoría del trabajo hasta la fecha ha demostrado que gran parte de la endocitosis de GPCR está regulada principalmente por GRK y procesos dependientes de β-arrestina que involucran clatrina pozos.

Quinasas GPCR

Como se muestra para múltiples GPCR, las GPCR quinasas específicas de serina / treonina (GRK) se reclutan después de la unión del agonista a la superficie citoplásmica del receptor activado, lo que conduce a la fosforilación del receptor. La superficie fosforilada del GPCR es entonces competente para servir como plataforma para la translocación del citosol a la membrana de las proteínas β-arrestina (revisado por Shenoy y Lefkowitz 53).

La familia de quinasas GRK está compuesta por 7 miembros que comparten una homología estructural y de aminoácidos significativa (revisado anteriormente 54,55). Dentro de esta familia, 4 quinasas (GRK 2, 3, 5 y 6) se expresan ampliamente y se cree que juegan un papel en la fosforilación de GPCR dentro del sistema cardiovascular. GRK2 y GRK3 residen en el citosol en ausencia de agonista y se trasladan a la membrana después de la estimulación con GPCR. La translocación de GRK2 / 3 y la localización de la membrana están mediadas en parte por su unión a las subunidades βγ de la proteína G heterotrimérica. 56 GRK5 y GRK6, por otro lado, están constitutivamente localizados en la membrana plasmática. Mientras que la palmitoilación de GRK6 es esencial para la asociación de la membrana, se cree que la localización de GRK5 en la membrana plasmática es atribuible a una interacción electrostática entre el extremo carboxilo muy básico de GRK5 y los fosfolípidos en la membrana plasmática. 58,59

Aunque la fosforilación específica de GRK de la superficie citoplásmica de los GPCR ocupados por agonistas media el reclutamiento de β-arrestina, las características estructurales comunes a los receptores activados que son reconocidos por los GRK siguen siendo en gran parte desconocidos. De hecho, es una cuestión de fundamental importancia cómo los miembros de este grupo limitado de GRK ampliamente expresados ​​son capaces de fosforilar una serie tan diversa de GPCR activados y de ese modo conducir al reclutamiento de β-arrestina.

Funcionalmente, se pueden definir 2 clases de GPCR, denominadas "clase A" y "clase B", basándose en la estabilidad relativa de la interacción GPCR / β-arrestina. Para el β2-AR (un receptor de clase A) y el receptor de vasopresina (un receptor de clase B), estos determinantes parecen estar presentes dentro de los terminales carboxilo de los receptores, como la estabilidad de su interacción con la β-arrestina, así como su capacidad para ser desfosforilado, reciclado y resensibilizado se invirtió completamente en los receptores mutantes en los que se intercambiaron sus colas carboxilo-terminales. 60

Curiosamente, mientras que los estudios in vitro han localizado sitios de fosforilación mediados por GRK2 y GRK5 de la β2-AR a la porción distal de la cola citoplásmica del receptor, 61 estudios más recientes en células intactas han sugerido que el agonista indujo β2La fosforilación de -AR se produce en la porción proximal del extremo carboxilo terminal del receptor. 62 Aunque el β observado2Se creía que la fosforilación de la cola proximal de -AR estaba mediada por GRK en lugar de la proteína quinasa A, esto no se confirmó. Por tanto, aunque la fosforilación mediada por GRK de los GPCR estimulados por agonistas subyace al reclutamiento de β-arrestina y, por lo tanto, inicia la endocitosis de GPCR en los CCP, quedan por determinar muchos de los detalles moleculares. En particular, un estudio reciente que utilizó interferencia de ARN de alto rendimiento implicó a los GRK como un papel más general en el proceso de endocitosis mediada por clatrina en sí. 63

Β-Arrestin como proteína adaptadora endocítica

Dentro de los seres humanos, existen 2 isoformas de las proteínas β-arrestina no visuales, a saber, β-arrestina1 y β-arrestina2, las cuales muestran una distribución tisular ubicua. Además de su función bien descrita en la limitación de la interacción entre el receptor y la proteína G, las proteínas β-arrestina también sirven para reclutar y conectar físicamente el receptor con la maquinaria endocítica. Experimentalmente, las mutaciones del receptor que alteran la fosforilación de GPCR inducida por agonistas limitan el reclutamiento de β-arrestina y conducen a una mala internalización del receptor, como se demostró para un β2-AR en el que se habían alterado todos los sitios de fosforilación de GRK. 48 Además, la expresión de proteínas β-arrestina mutantes "dominantes negativas" (tales como β-arrestina1 V53D o β-arrestina2 V54D) inhibe la β-arrestina2-Internalización AR. 64 Además, las propias proteínas β-arrestina pueden interactuar directamente con los componentes esenciales de la maquinaria de la cubierta de la vesícula recubierta de clatrina (CCV), a saber, el complejo heterotetramérico AP-2, 8 así como la clatrina, 9 y estas interacciones son crítico tanto para el reclutamiento de la β2-AR en fosas recubiertas de clatrina, así como para la internalización del receptor. Estudios con otros GPCR, incluido el α2-AR 65 y la A2B El receptor 66 de adenosina también ha mostrado papeles importantes para las β-arrestinas en la endocitosis del receptor.

Curiosamente, aunque las 2 isoformas de β-arrestina exhiben casi un 80% de identidad de aminoácidos, 6 no parecen desempeñar funciones biológicas redundantes y, de hecho, exhiben diferencias en su regulación. Mientras que la β-arrestina1 es fosforilada por enzimas quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), la 67 β-arrestina2 es fosforilada por la caseína quinasa II. 68 Sin embargo, para ambas proteínas β-arrestina, el estado de fosforilación / desfosforilación parece regular la capacidad de la proteína β-arrestina para promover la internalización de la β-arrestina2-AR a través de vesículas recubiertas de clatrina.

Como se señaló anteriormente, el análisis de la translocación de β-arrestina estimulada por agonistas para una variedad de GPCR sugiere que existen 2 clases de receptores en gran medida distintas con las que se asocian las β-arrestinas, denominadas GPCR de clase A y clase B. Después de la exposición a agonistas, los receptores de clase A, incluido el β2-AR, receptor de endotelina A y α1b-AR recluta preferentemente β-arrestina2. 69 Por el contrario, los receptores de clase B, incluido el AT1aR y V2 receptor, son capaces de unirse a ambas isoformas de β-arrestina con una afinidad casi igual. 70 Mientras que las interacciones del receptor de β-arrestina1 / 2-clase A ocurren únicamente en la membrana plasmática y se pierden después de la internalización de GPCR, las interacciones de β-arrestina1 / 2 con receptores de clase B son mucho más estables y pueden detectarse en las estructuras endosómicas después de la endocitosis del receptor (revisado por Pierce y Lefkowitz 71). Además, los receptores de clase A generalmente se reciclan a la membrana plasmática rápidamente, mientras que los GPCR de clase B se reciclan más lentamente. El papel de la ubiquitinación en la modulación de la interacción GPCR / arrestina es probablemente importante y se analiza a continuación. Los fibroblastos embrionarios de ratón generados para carecer de ambas isoformas de β-arrestina mostraron un marcado deterioro de la internalización estimulada por agonistas de la clase A β2-AR o la clase B AT1aR, mientras que solo β2La internalización de -AR se vio afectada por la deleción única de la isoforma β-arrestina2. 69 Los estudios que utilizan tecnología de interferencia de ARN para la ablación selectiva de las proteínas β-arrestina han mostrado resultados similares con respecto a la internalización de la β-arrestina2-AR y AT1-AR como modelo de receptores de clase A y B, respectivamente. 72

Ubiquitinación y clasificación de GPCR inducida por agonistas

Recientemente se ha demostrado que la modificación postraduccional de las proteínas del sustrato mediante la unión covalente de ubiquitina (ubiquitinación), originalmente descubierta en el contexto de la degradación de proteínas celulares, desempeña un papel no canónico en la regulación de la clasificación postendocítica de varias proteínas de membrana, incluidos los GPCR. 73,74 La ubiquitinación de proteínas está mediada por la acción concertada de 3 enzimas. Las 2 primeras enzimas (E1 y E2) son responsables, respectivamente, de activar la ubiquitina y escoltar a la ubiquitina activada. La tercera enzima, ubiquitina ligasa E3 (E3), reconoce y modifica el sustrato de manera oportuna. 75 Para la β2-AR, tanto la fosforilación mediada por GRK como la unión de β-arrestina son esenciales para que se produzca la ubiquitinación del receptor. 76 Es importante destacar que esta β estimulada por agonistas2La modificación de ubiquitinación -AR es necesaria para que el receptor sufra degradación en lisosomas. Además, la degradación lisosomal dependiente de ubiquitina es aplicable a otros GPCR como V2R y el receptor 2 activado por proteasa (PAR2). 77,78 Tanto para la β2-AR y V2La ubiquitinación del receptor R requiere las proteínas β-arrestina. Aunque la naturaleza de este requisito no está del todo clara, una suposición es que las β-arrestinas pueden servir como adaptadores para llevar ligasa (s) E3 aún no identificadas a los receptores de una manera dependiente del estímulo. En el caso de los receptores PAR2 y CXCR4, la ubiquitinación está mediada por las ligasas E3 c-Cbl 78 y AIP4, 79 respectivamente, pero aún no se ha demostrado la participación de las β-arrestinas.

Para los GPCR de mamíferos anteriores, así como para otros tales como el receptor de quimiocina CXCR4, la ubiquitinación del receptor 80 no es necesaria para la internalización per se, pero es crucial para la clasificación de los receptores ubiquitinados a lisosomas. Un estudio reciente de la β1-AR en un sistema celular heterólogo informó la resistencia de la proteína receptora a la ubiquitinación, así como a la degradación mediada por agonistas, lo que sugiere una fuerte relación entre la modificación de este receptor y las vías de regulación a la baja. 81

Mientras que se sabe que la degradación de GPCR y otras proteínas de membrana ocurre en los lisosomas, la de algunos receptores de membrana, como el receptor de eritropoyetina que atraviesa una sola membrana, involucra tanto a los lisosomas como a los proteasomas 26S, los complejos de megaproteasas que degradan la mayoría de las proteínas celulares. 82 Es interesante, sin embargo, que un informe reciente sugiere que la ubiquitinación y la degradación proteasomal de A intracelular recién sintetizado2A Los receptores de adenosina sirven como método de control de calidad de ER (Figura, A). Es importante destacar que esta degradación podría superarse mediante la coexpresión de USP4, una enzima deubiquitinante que pertenece a una familia de enzimas que catalizan la eliminación de ubiquitina de los sustratos modificados. 83 La expresión de la USP4 condujo a una expresión funcional más robusta de la A2A receptor en la membrana plasmática, lo que sugiere que la desubiquitinación puede facilitar el direccionamiento de las proteínas de la membrana a la superficie celular (Figura, A).

Por otro lado, la internalización de GPCR puede ser regulada por la ubiquitinación dependiente de agonistas de β-arrestina por la ligasa E3 Mdm2, como se demostró para β2-ARKANSAS. 76 Además, la estabilidad de la unión de β-arrestina / GPCR que define a los GPCR como clase A o B (como se describió anteriormente) también se correlaciona con el estado de ubiquitinación de las proteínas de β-arrestina. La separación de la β-arrestina de los GPCR de clase A resulta de la desubiquitinación rápida de la β-arrestina, mientras que la interacción más estable de la β-arrestina con los receptores de la clase B es causada por la ubiquitinación sostenida de la β-arrestina. 84 Como se describirá a continuación, la ubiquitinación de la β-arrestina parece no solo ser capaz de regular las propiedades de tráfico de GPCR, sino que probablemente también desempeña un papel importante en la dirección de los eventos de señalización aguas abajo.

Clasificación de señales utilizadas para el tráfico intracelular y la endocitosis de GPCR

La identificación de señales de aminoácidos lineales y cortas presentes en los dominios intracelulares de las proteínas transmembrana responsables de mediar la clasificación intracelular y la endocitosis de una proteína transmembrana de la membrana plasmática ha sido el foco de mucho trabajo durante las últimas dos décadas. Se cree que tales secuencias actúan como sitios de reconocimiento para componentes de la maquinaria de la proteína adaptadora celular necesaria para el tráfico de proteínas intracelulares. La importancia de tales señales contenidas dentro de los dominios intracelulares de los GPCR, sin embargo, está menos descrita que la de otras proteínas transmembrana. Aunque limitado en número, se han delineado excepciones al paradigma general de endocitosis mediada por GRK / β-arrestina para los receptores de siete membranas importantes para el sistema cardiovascular. Curiosamente, los motivos mejor descritos son análogos a los utilizados por los receptores transmembrana no GPCR e incluyen motivos basados ​​en di-leucina (LL o LXL) y basados ​​en tirosina (NPXY o NPXXY o YXXO).

Como prototipo de GPCR, el β2-AR contiene un motivo de di-leucina dentro de su terminal carboxilo, cuya alteración no afecta la capacidad del receptor para transitar correctamente a la superficie celular, unirse al agonista o activar la adenilil ciclasa. Sin embargo, la adición de agonistas no conduce a la internalización de este β mutante2-AR, 85 demostrando un papel para el motivo di-leucina del β2-AR en endocitosis de receptores inducida por agonistas. De manera similar, las mutaciones introducidas en el motivo de leucina en la cola citoplasmática del receptor de vasopresina 1a (V1aR) internalización del receptor inducida por agonistas significativamente deteriorada. 86 Curiosamente, sin embargo, la mutación del motivo análogo di-leucina en el V2R resultó en un receptor que no pudo escapar del ER, lo que sugiere un papel para este motivo en V2R maduración. 87

También se ha demostrado que las señales de clasificación basadas en tirosina son necesarias en el tráfico de β2-ARKANSAS. Mutación de Y326 en el β humano2-AR, ubicado en la unión propuesta del séptimo dominio transmembrana y la porción proximal del término carboxilo y conservado en posición a través de muchos miembros de la gran superfamilia de GPCR, no afecta la capacidad del receptor para transitar correctamente a la célula de superficie, se unen al agonista o para activar la adenilil ciclasa cuando el receptor está sobreexpresado. 88 La mutación, sin embargo, abolió completamente la β2-Internalización inducida por agonistas AR. Sin embargo, esta interpretación fue complicada por el hallazgo de que los niveles de expresión más bajos de β mutante2-AR dio como resultado la pérdida de la unión del ligando y el acoplamiento de la adenilil ciclasa, probablemente debido a la retención intracelular del receptor mutante. 89 Más recientemente, un motivo basado en tirosina altamente conservado (YXXO) en la cola citoplasmática del receptor 1 activado por proteasa (PAR1), un GPCR para trombina, que previamente se había demostrado que experimentaba internalización independiente de β-arrestina, fue demostrado ser necesario para la internalización mediada por agonistas pero no constitutiva. 90 Finalmente, estudios más recientes han demostrado una interacción directa entre un tramo de 8 argininas contenidas en el terminal carboxilo del α1b-AR y la subunidad AP-2 μ. 91 Si el motivo alternativo basado en tirosina encontrado en PAR1 o el motivo arginina no clásico identificado en el α1b-AR juega un papel en la endocitosis y el tráfico intracelular de otros GPCRs clásicamente identificados como fundamentalmente importantes para el sistema cardiovascular aún no se ha determinado.

Papel de las proteínas adicionales en la endocitosis de los GPCR

Además de las funciones bien reconocidas de las proteínas GRK y β-arrestina en la internalización de GPCR, se ha demostrado que muchas otras proteínas son importantes en el proceso endocítico. A continuación se analiza una lista parcial y una descripción del papel que juegan estas proteínas en la endocitosis de GPCR.

Factor 6 de ADP-ribosilación

El factor de ribosilación de ADP 6 (ARF6) es un miembro de la familia ARF de pequeñas proteínas de unión a GTP que se sabe que son actores clave en los eventos de tráfico vesicular. Además de su papel en la unión de AP-2 y clatrina, la β-arrestina también puede unirse directamente a ARF6 y modular su actividad. La activación de ARF6 requiere el intercambio de GTP por GDP, una reacción que es catalizada por el factor de intercambio de nucleótidos de guanina ARF (GEF) ARNO (sitio de unión de nucleótidos O pener de ARF). Es importante destacar que ARNO está constitutivamente asociado con β-arrestina2. 92 Como se muestra para la β2-AR, expresión de proteínas ARF6 mutantes que contienen sustituciones de un solo aminoácido que las vuelven deficientes en su capacidad para unirse (T27N) o hidrolizar (Q67L) β inducida por agonistas inhibidos por GTP2-Internalización AR. 92 Sin embargo, la sobreexpresión de ARNO solo aumenta la β2-Internalización de AR estimulando el intercambio de nucleótidos GTP en ARF. Por tanto, el reclutamiento de β-arrestina promovido por agonistas a un receptor activado conduce a la regulación local de la endocitosis por β-arrestina atribuible a su capacidad inherente para unirse tanto a ARNO como a ARF6.

Además de requerir una proteína GEF, las proteínas ARF también requieren una proteína activadora de GTPasa (GAP) para acelerar la hidrólisis del GTP unido. Inicialmente identificadas como proteínas que interactúan con GRK (GIT), GIT1 y GIT2 son proteínas que contienen dedos de zinc que funcionan como GAP para ARF6. 93,94 La sobreexpresión de GIT1 reduce la internalización de los receptores transmembrana en los CCP y CCV, incluido el β1- y β2-AR, el receptor de adenosina 2B y el M1-receptor muscarínico. 95 Es importante destacar que la actividad ARF-GAP de las proteínas GIT es estimulada por el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, mientras que otras ARF-GAP, como ARF-GAP1, son estimuladas por el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato y diacilglicerol. 94 Esto plantea la interesante posibilidad de que la regulación GIT de la actividad de ARF6 pueda integrarse mediante la activación de la vía de señalización de la fosfatidilinositol 3-quinasa.

Fosfatidilinositol 3-quinasa

Las 3-quinasas de fosfatidilinositol (PI3K) son una familia conservada de quinasas con actividad tanto de lípidos como de proteína quinasas que pueden activarse en respuesta a la estimulación de GPCR. Como familia, se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en una serie de funciones celulares tan divergentes como la supervivencia celular, la motilidad celular y la endocitosis del receptor. Dentro del citosol, PI3K forma un complejo constitutivo con GRK2. 96 Como se demostró para la β2-AR, la unión del agonista induce la translocación del complejo GRK / P13K al receptor activado, la formación de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato y el posterior reclutamiento de AP-2 y clatrina, lo que conduce a la endocitosis del receptor. Es importante destacar que la internalización del receptor se bloquea por la sobreexpresión de la porción de PI3K que media su interacción con GRK2, así como por la 3,4,5 trifosfato lípido fosfatasa PTEN específica, lo que demuestra la importancia de la actividad lípido quinasa de PI3K para la producción localizada. de fosfoinosítidos D-3 en la regulación de la endocitosis inducida por ligando del β2-ARKANSAS. 97

Como se señaló anteriormente, además de poseer actividad lípido quinasa, los miembros de la familia PI3K también pueden funcionar como proteína quinasas, aunque la importancia de esta actividad ha permanecido en gran parte oscura dado el número limitado de sustratos proteicos reconocidos por PI3K. 98 Recientemente, sin embargo, la importancia de la actividad de la proteína quinasa PI3K en la regulación de β2-Se ha iluminado la endocitosis AR. En un elegante estudio, Naga Prasad et al identificaron la proteína citoesquelética no muscular tropomiosina (una proteína de unión al filamento de actina) como sustrato para la isoforma γ de PI3K y demostraron además que PI3K puede fosforilar selectivamente un solo sitio (S61) dentro de la tropomiosina. 99 La alteración de este sitio dentro de la tropomiosina para imitar la fosforilación constitutiva (S61D) conduce a la complementación de una PI3K defectuosa en la proteína quinasa, mientras que el cambio a un residuo deficiente en fosfo (S61A) bloqueó la β inducida por agonistas.2-Internalización AR. Por lo tanto, a través de su actividad lipídica y quinasa, PI3K juega un papel central en la eliminación inducida por agonistas de la β2-AR, el modelo prototípico cardiovascular GPCR, de la superficie celular. Actualmente se desconoce si este paradigma se extenderá a otros miembros de la familia de GPCR cardiovasculares, pero parece probable, dado que la endocitosis a través de CCV que contienen AP-2 es el mecanismo predominante de internalización para la mayoría de los GPCR activados por ligando.

Tráfico intracelular: clasificación / reciclaje / degradación

Una vez internalizados desde la superficie celular, los GPCR se pueden clasificar a lo largo de múltiples vías (Figura, C). Pueden sufrir desfosforilación, resensibilización y reciclarse a la membrana plasmática. Alternativamente, los GPCR pueden dirigirse a la degradación a través de la ruta endosomal / lisosomal. Por último, se ha demostrado más recientemente que múltiples GPCR inician vías de señalización intracelular independientes de la proteína G después de la endocitosis, como se analiza a continuación. Estos múltiples destinos de tráfico para los GPCR internalizados son el tema de una excelente revisión reciente. 100 Nos gustaría destacar algunas proteínas importantes para estos procesos.

Factor regulador del intercambiador de Na + / H +

Después de la estimulación de los receptores adrenérgicos, se ha reconocido desde hace mucho tiempo que se producen cambios dependientes de la proteína G en el metabolismo celular, la excitabilidad y el crecimiento. 101 Asimismo, se han demostrado cambios celulares aparentemente independientes de la activación de la proteína G, incluyendo alteraciones en el pH celular a través de la regulación del intercambiador Na + / H +. Un trabajo reciente ha establecido que la estimulación agonista de la β2-AR promueve la asociación directa del extremo carboxilo terminal del receptor con el primer dominio PDZ dentro del factor regulador 1 del intercambiador de Na + / H + (NHERF1). 102 Se ha demostrado que ocurren asociaciones similares para otros GPCR que contienen secuencias que se ajustan al motivo consenso DS / TxL, incluido el receptor P2Y1 purinérgico y el CFTR, 103 mientras que otros GPCR, como el receptor 104 de la hormona paratiroidea, interactúan con ambos PDZ dominios de NHERF1 y NHERF2 a través de un motivo consenso PDZ ligeramente diferente (ETVM). Para el β2-AR, la interrupción de esta interacción altera notablemente los cambios inducidos por agonistas en el pH intracelular.

NHERF también es de importancia crítica para la clasificación intracelular adecuada de la β2-ARKANSAS. Además de su capacidad para unirse al extremo carboxilo terminal de la β2-AR a través de su dominio PDZ, NHERF puede, a través de su dominio ezrin-radixin-moesin (ERM), unirse al citoesqueleto de actina a través de la asociación con proteínas ERM. Es importante destacar que las mutaciones generadas para interrumpir la interacción de NHERF con el β2-AR carboxyl terminal o con proteínas ERM conducen a una degradación lisosomal significativa inducida por agonistas de la β2-AR después de la endocitosis, en lugar de reciclarse. 105 Como se señaló anteriormente, se ha demostrado que múltiples GPCR adicionales interactúan con las proteínas NHERF. Aunque se ha demostrado que el NHERF juega un papel en el reciclaje de otros GPCR como el receptor opioide κ (revisado por Liu-Chen 106), la generalización del papel que juega el NHERF en el reciclaje de otros GPCR, particularmente en el sistema cardiovascular , queda por determinar.

Norte-Proteína de fusión sensible a etilmaleimida

En un estudio para identificar compañeros de unión de β-arrestina, se descubrió que β-arrestina1 interactúa en ensayos de levadura 2 híbridos e in vitro con norte-proteína de fusión sensible a etilmaleimida (NSF), una ATPasa esencial para muchas funciones de transporte intracelular. 107 Además, la sobreexpresión de NSF en células HEK293 condujo a un aumento de β inducido por agonistas2-AR internalización y podría rescatar los efectos de un mutante β-arrestina1 (S412D) que previamente se demostró que funciona como un negativo dominante para β2-Internalización AR. Curiosamente, la β2-AR también puede, a través de su extremo carboxilo terminal, unirse directamente a NSF. 108 El β2-La interacción AR / NSF depende de agonistas y es un requisito para la eficacia de β mediada por agonistas2-Internalización AR. Es importante destacar que, mientras que β de tipo salvaje2-Los AR se reciclan a la superficie celular después de la exposición al antagonista propranolol, β2-Los AR que contienen mutaciones en sus extremos carboxilo distales permanecen secuestrados intracelularmente, lo que demuestra la importancia de la β2-Interacción AR / NSF para una β adecuada2-Reciclaje AR. Por tanto, aunque está claro que las proteínas que se unen a los extremos carboxilo terminales de los GPCR, como NHERF y NSF, sirven para regular la clasificación intracelular de los receptores como el β2-AR, queda por dilucidar hasta qué punto el tráfico de otros GPCR está modulado por estas o proteínas similares aún no identificadas.

Clasificación de Nexin 1

Después de la internalización, los GPCR pueden reciclarse a la membrana plasmática o someterse a clasificación en la ruta endosomal / lisosomal para su degradación. Aunque es fundamentalmente importante como mecanismo para la regulación a la baja de ciertos GPCR, como el PAR1, que reconoce la proteasa coagulante trombina, se sabe comparativamente menos acerca de los componentes moleculares que dirigen la clasificación postendosómica y el reciclaje de los receptores.

Aunque la clasificación de la nexina 1 (SNX1) se identificó originalmente como una proteína asociada a la membrana que interactúa con el receptor de tirosina quinasa, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y funciona en la clasificación de EGFR a los lisosomas, también se ha demostrado que 109 SNX1 interactúa con PAR1 en de una manera dependiente de agonistas. 110 La sobreexpresión de un mutante de deleción terminal carboxilo SNX1 no afectó significativamente la internalización y acumulación de PAR1 inducida por agonistas en endosomas tempranos, pero pudo impedir la clasificación de PAR1 de endosoma a lisosoma y, por lo tanto, inhibió marcadamente la degradación de PAR1. 110 Estudios adicionales, en los que el agotamiento de SNX1 endógeno en células HeLa a través de una pequeña tecnología de ARN interferente perjudicó notablemente la degradación de PAR1 inducida por agonistas, refuerzan la sugerencia de que SNX1 desempeña un papel en el tráfico intracelular de PAR1 desde endosomas a lisosomas. 111 Queda por determinar si SNX1 u otras proteínas SNX pueden mediar en la clasificación endosómica a lisosómica de GPCR distintos de PAR1, pero es ciertamente posible dada la conservación general de los temas de tráfico compartidos entre los miembros de esta gran familia de proteínas.

Rab GTPasas

Una segunda clase de proteínas que se ha demostrado que regulan el movimiento de los GPCR tanto durante como después de la endocitosis son las proteínas Rab, una familia de pequeñas proteínas de unión a GTP similares a Ras. Es importante destacar que diferentes miembros de la familia Rab GTPasa se asocian selectivamente con estructuras intracelulares específicas que incluyen tanto el reciclaje como la clasificación de endosomas, donde median múltiples pasos del tráfico de la membrana vesicular, incluida la gemación, el acoplamiento y la fusión de vesículas (revisado por Seachrist y Ferguson 112).

Dentro del sistema cardiovascular, Rab5 juega un papel central en la internalización mediada por CCV agonista dependiente y la localización endosómica temprana de algunos GPCR, incluido el β2-ARKANSAS. 113 Expresión de un Rab5 (S34N) negativo dominante bloqueado β2-AR internalización, mientras que un Rab5 constitutivamente activo (Q79L) no alteró significativamente β2-Internalización AR. Curiosamente, mientras que la β2-AR no puede asociarse directamente con Rab5, el AT1R se une a Rab5 directamente a través del extremo carboxilo del receptor y se localiza en estructuras endosomales que contienen Rab5 después de la endocitosis. 114 Además, la interacción de Rab5 con el AT1La R en los endosomas parece ser necesaria para prevenir la clasificación del receptor internalizado en lisosomas. 115 A diferencia de la internalización de la β2-AR, sin embargo, endocitosis del AT1R no parece depender de Rab5, 114, lo que demuestra la diversidad intracelular en las funciones de tráfico de GPCR desempeñadas incluso por miembros individuales de la familia de proteínas Rab.

Mientras que Rab5 juega un papel en los eventos de tráfico de GPCR asociados con la internalización de GPCR y / o la formación endosómica temprana, varios miembros adicionales de la familia Rab han sido implicados en otros eventos de tráfico de GPCR, incluidos Rab4 y Rab11 en el reciclaje de receptores, y Rab7 en la clasificación endosomal a lisosomal . 115 En un modelo de ratón transgénico en el que se sobreexpresaba un Rab4 (S27N) dominante negativo en el corazón, los ratones tenían una capacidad de respuesta alterada tanto a las catecolaminas endógenas como exógenas. 116 Además, cuando estos ratones se cruzaron con ratones que también sobreexpresaban una β humana específica para el corazón2-AR, los ratones resultantes tenían una β vesicular intracelular anormal2-Acumulación de AR, así como una reducción significativa de la contractilidad cardíaca. Dichos resultados sugieren que la regulación adecuada de β mediada por Rab42El reciclaje del receptor -AR es necesario para el mantenimiento de la capacidad de respuesta normal a las catecolaminas y la resensibilización del receptor. Actualmente se desconoce si Rab4 también juega un papel similar in vivo en el reciclaje de otros GPCR dentro del sistema cardiovascular. Para una revisión más completa de las diversas funciones que desempeñan los miembros de la familia de proteínas Rab en casi todos los aspectos del tráfico de GPCR, consulte varias revisiones excelentes recientes. 100,112

Otras proteínas con funciones en la endocitosis de GPCR y el tráfico postendocitótico

Se han identificado y caracterizado muchas proteínas adicionales que desempeñan funciones fundamentales en la endocitosis y el tráfico postendocítico de GPCR. Estos incluyen, pero no se limitan a, proteínas involucradas en la formación de CCV y la escisión de la membrana como AP-2, clatrina, dinamina, Hrs y GASP, 117-119, así como múltiples proteínas de andamiaje que se ha demostrado que interactúan con la β.1-AR incluyendo densidad postsináptica 95 (PSD95), 120 guanilato quinasa invertida asociada a membrana-2 (MAGI-2), 121 y las endofilinas. 122 Debido al alcance limitado de esta revisión, hemos optado por resaltar solo proteínas seleccionadas como se indicó anteriormente.

Internalización / Tráfico y señalización

Aunque los mecanismos de internalización que conducen al secuestro del receptor lejos de la fuente de estímulo se han considerado principalmente como vías de desensibilización de señales, ahora existe una gran cantidad de investigaciones que respaldan la señalización continua que se combina con la endocitosis de GPCR. 123 Además, aunque generalmente se cree que las "direcciones" endocíticas determinan el alcance de la señalización, los mecanismos de señalización continua durante el tráfico de proteínas pueden determinar la ruta endocítica exacta regulando procesos como la fusión de vesículas y la transferencia de carga. Como tal, es cada vez más evidente que los 2 procesos, tráfico y señalización, no solo están conectados, sino que probablemente están inextricablemente entrelazados (Figura, D).

En el caso de los GPCR, se ha demostrado claramente que la β-arrestina juega un papel esencial en la desensibilización de la señalización del segundo mensajero mediada por la proteína G. Más recientemente, sin embargo, también se ha demostrado que las proteínas β-arrestina facilitan la internalización del receptor a través de CCV, así como acoplan los receptores y activan las tirosina quinasas no receptoras (p. Ej., Miembros de la familia c-Src), por lo que median una segunda ola de señalización. 124,125 Además, al unirse a GPCR activados como el AT1aTambién se ha demostrado que la R, β-arrestina es capaz de secuestrar y estructurar quinasas de señalización, así como de dirigir complejos de señalización activos en microcompartimentos endosomales citoplasmáticos. 125,126 Es importante destacar que la inhibición química o molecular de la endocitosis del receptor (o, alternativamente, la expresión de mutantes de β-arrestina que perjudican la internalización del receptor), puede conducir a una disminución en dicha señalización descendente, lo que demuestra un acoplamiento entre endocitosis y señalización. 124,127

Además de la activación de c-Src, se ha demostrado en múltiples estudios que la β-arrestina funciona como un intermedio de señalización en la transducción de señales de GPCR a las rutas de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), en condiciones en las que el acoplamiento de la proteína G está prácticamente ausente. 125,128,129 Aunque esta señalización dependiente de β-arrestina se ha caracterizado mejor para la activación de ERK, también puede aplicarse a otras quinasas de señalización y parece desempeñar funciones en una variedad de respuestas celulares, incluidas la quimiotaxis y la antiapoptosis. Aunque todavía no se ha determinado de manera concluyente que la endocitosis del receptor sea necesaria para esta vía de β-arrestina, datos recientes sugieren que los patrones de tráfico de los complejos de β-arrestina / receptor pueden desempeñar un papel importante. 130,131 Curiosamente, la ubiquitinación de β-arrestina en sitios aceptores específicos (p. Ej., Ubiquitinación de lisinas 11 y 12 inducida por Ang II en β-arrestina2) es crucial para la β-arrestina / AT estable1Interacción R, así como la formación y localización endosomal de AT1Signalosomas R-MAPK. Actualmente se desconoce si esta observación puede ser ampliamente aplicable a otros GPCR relevantes para la biología cardiovascular y es un área de investigación activa.

Conclusiones

Dentro del sistema cardiovascular, la regulación del tráfico de GPCR es de fundamental importancia tanto para la homeostasis fisiológica como para la respuesta molecular a la perturbación fisiológica. Existe un movimiento eficiente y coordinado de los GPCR desde la síntesis hasta la superficie celular, donde pueden interactuar con componentes del medio extracelular para transducir señales a los efectores intracelulares y la posterior recuperación de GPCR de la superficie celular. Estos procesos resaltan el intrincado equilibrio celular que se ha desarrollado para regular de manera exquisita la capacidad de respuesta hormonal a nivel de los tejidos. De hecho, se ha aprendido mucho sobre el tráfico de GPCR dentro del sistema cardiovascular durante las últimas dos décadas, como lo demuestra el conjunto en constante expansión de proteínas identificadas cruciales para este proceso. El reconocimiento reciente de que la señalización de GPCR puede ocurrir dentro del sistema cardiovascular a través de vías independientes de la proteína G / dependientes de β-arrestina plantea la fascinante posibilidad de que se puedan desarrollar ligandos cardiovasculares farmacológicamente relevantes que permitan la señalización selectiva de GPCR a través de la activación de proteínas que inicialmente se creía solo tener un papel en la limitación de la señalización de GPCR y promover la eliminación de GPCR de la superficie celular.

Original recibido el 30 de junio de 2006 Revisión recibida el 10 de agosto de 2006 aceptado el 11 de agosto de 2006.

Agradecemos a Donna Addison y Elizabeth Hall por su excelente asistencia de secretaría.


Si una célula tiene dos GPCR diferentes, ¿cómo diferencia la célula entre la cascada de fosforilación causada por cada uno? - biología

C2006 / F2402 '14 ESQUEMA DE LA CONFERENCIA # 14

(c) 2014 Dra. Deborah Mowshowitz, Universidad de Columbia, Nueva York, NY. Última actualización 09/03/2014 12:35 PM.

Folletos: 14A - Señalización: GPCR, proteínas G y cAMP
14B - Homeostasis - Vista de balancín para la regulación de la glucosa y la temperatura
14C
- Revestimiento del circuito típico GI Tract & amp

Cubriremos mucho sobre hormonas. Un hipertexto de endocrinología con algunas animaciones está en
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/index.html


I. Papel de las proteínas G y los segundos mensajeros en la señalización, cont.

A. ¿Cuáles son las propiedades importantes de las proteínas G? Véase la fig. De Becker. 14-5, Folleto 14A.

  • La proteína G se activa descargando GDP y recogiendo GTP en respuesta a alguna señal.
  • NO se activa por fosforilación del GDP unido a GTP.
  • La activación se llama intercambio GDP / GTP; más detalles a continuación

B. Inactivación: La proteína G se inactiva a sí misma catalizando la hidrólisis de GTP a GDP.

C. ¿Por qué es un cambio? La proteína G no permanece activa por mucho tiempo. `` Se apaga solo ''.

B. Vía típica: función en la señalización (ver también el folleto 14A, panel central)

ligando (primer mensajero) se une fuera de la célula activar el receptor en la membrana activar la proteína G en la membrana activar la enzima diana en la membrana generar molécula pequeña (segundo mensajero) dentro de la célula

una. Terminología: Tenga cuidado de no confundir las proteínas G (activadas por receptores) y los GPCR (los receptores reales en la membrana).

B. Localización: El ligando (primer mensajero) se une al dominio extracelular de su receptor. Los eventos restantes están dentro de la celda.

C. Respuesta: La acción del segundo mensajero (que se explica a continuación) conduce a una respuesta específica en cada tipo de célula receptiva. Respuestas típicas:

(1) liberación de glucosa del almacenamiento en el hígado en respuesta a la epinefrina.

(2) síntesis y liberación de TH (hormona tiroidea) de la glándula tiroides en respuesta a TSH (hormona estimulante de la tiroides)

C. ¿Qué son los segundos mensajeros? ¿Cómo encajan? Consulte el folleto 14A o la fig. De Sadava. 7,7 (7,8). A continuación se tratan más detalles y ejemplos.

  • La proteína G activa (subunidad) & # 8594 se une y activa la enzima en (o asociada con) la membrana.
  • La enzima activada & # 8594 genera un segundo mensajero, en el citoplasma y / o la membrana.
  • Los detalles de la vía de cAMP se encuentran a continuación. Véase la fig. De Becker. 14-7 o higos Sadava. 7,12 (7,14).
  • Llegaremos a la vía IP3 más tarde. Si tiene curiosidad, consulte la fig. De Becker. 14-10 o Sadava fig. 7,13 (7,15).

II. ¿Cómo actúan las proteínas G?

A. Activación e inactivación de proteínas G en general

1 . Reacciones de activación & amp inactivación

una. Reacción de activación (Intercambio GTP / GDP, NO fosforilación del GDP GTP reemplaza al GDP):

Proteína-GDP (inactivo) + GTPProteína-GTP (activa) + GDP

B. Reacción de inactivación (hidrólisis de GTP unido a GDP):

Proteína-GTP (activa)Proteína-GDP (inactiva) + fosfato.

C. En general: GTP desplaza a GDP, activando la proteína G GTP luego se hidroliza (generalmente rápidamente), devolviendo la proteína G a su estado inactivo.

(1). Efecto neto sobre la hidrólisis de GTP - GTP: GTP (+ agua)GDP + fosfato

(2). NetoEfecto sobre la proteína G - ninguno: La proteína se activa temporalmente, pero luego se inactiva. Sin embargo, los ciclos de proteínas de inactivos a activos y de regreso a inactivos actúan como un interruptor.

D. Terminología. Dado que el resultado general es que GTP se hidroliza a GDP, las proteínas G a veces se denominan `` GTPasas ''.

2. ¿Qué desencadena la activación?

una. Caso general: La unión de una proteína llamada GEF (factor de intercambio guanina-nucleótido) hace que el GDP se caiga y GTP se une.

B. En señalización: GPCR activado = GEF. La unión del receptor activado a la proteína G desencadena la activación de la proteína G (causa la pérdida de GDP).

3. ¿Qué desencadena la inactivación?

una. La proteína G en sí misma tiene actividad enzimática. - cataliza la inactivación (hidrólisis).

B. No se requiere disparador - la hidrólisis de GTP a GDP ocurre automáticamente.

C. Otras proteínas pueden aumentar la velocidad de hidrólisis. Se denominan proteínas RGS (Reguladores de la señalización de proteínas G) o proteínas GAP (Proteínas Activadoras de GTPasa).

4. ¿Cómo se comparan las proteínas G con las quinasas? Vea la tabla de abajo.

B. Tipos de proteínas G

1. Subunidades - Las proteínas G ordinarias son triméricas = tienen 3 subunidades.

una. G prot inactivo = heterotrímero de alfa, beta, gamma

B. La separación ocurre en la activación: En la activación, la subunidad alfa (con el GTP) se separa de otras 2 subunidades.

C. Cualquiera de las partes puede ser el efector que realmente actúa sobre el objetivo - alfa, o beta + gamma, puede actuar como activador o inhibidor de la proteína diana.

D. La hidrólisis provoca la reasociación. La hidrólisis de GTP a GDP hace que el alfa se vuelva a asociar con otras subunidades y el heterotrímero inactivo # 8594

2. Proteínas G pequeñas: se analizarán más a fondo cuando lleguemos al ciclo celular y al cáncer. Para referencia:

una. Estructura: Las proteínas G pequeñas no tienen subunidades.

B. Ejemplo: la proteína llamada ras, importante en el control del crecimiento, muchas células cancerosas tienen ras hiperactiva.

C. Papel del intercambio GTP / PIB: Se activan mediante el intercambio de GTP / GDP y se inactivan mediante la hidrólisis de GTP a GDP, como se indicó anteriormente.

D. Los GPCR no los activan directamente (Están involucradas otras proteínas adaptadoras del 'intermediario')

3 . ¿Cuántas proteínas G?

una. Hay muchas proteínas G diferentes. Las proteínas G están involucradas en una gran cantidad de procesos celulares, no solo en la señalización. (Hemos ignorado su importancia hasta ahora. Consulte Becker para obtener detalles y muchos ejemplos).

B. Las proteínas G activas pueden ser inhibidoras o estimulantes.

C. Método de acción: Las proteínas G activadas actúan uniéndose y activando (o inhibiendo) otras enzimas / proteínas diana.

D. Terminología: Las diferentes proteínas G triméricas se conocen generalmente como Gpag, Gq GRAMOI, Gs etc. (Los libros difieren en los detalles de los nombres).

C.Para referencia: Comparación de proteínas quinasas, proteínas quinasas receptoras y proteínas G amp triméricas

Proteína Cataliza ¿Qué se agrega a Target Protein? ¿Quién obtiene el P o el GTP? ¿Qué tan inactivo?
Proteína quinasa Proteína + ATP y # 8594 ADP + proteína-PAG Fosfato Por lo general, dif. proteína La fosfatasa separada elimina PAG
Trimérico
Proteína G
Intercambio e hidrólisis como se describe anteriormente. GTP Sí mismo Hidroliza GTP a GDP (por sí mismo)
Receptor de proteína quinasa ** Proteína + ATP y # 8594 ADP + proteína-PAG Fosfato Por lo general, una subunidad separada del yo La fosfatasa separada elimina PAG

** Las proteínas quinasas receptoras tienen un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio de quinasa intracelular (o de unión a quinasa). Las quinasas ordinarias suelen añadir fosfatos a otras proteínas. Las quinasas receptoras generalmente se agregan fosfatos a sí mismas. Por ejemplo, véase Sadava fig. 7,6 (7,7)

Pruebe los problemas 6-1 y 6-2.

III. Un ejemplo de un segundo mensajero: cAMP & amp its target (PKA) Consulte el folleto 14A o Becker fig. 14-7.

A. ¿Qué es cAMP? El segundo mensajero más famoso. Consulte el folleto 14A o Becker 14-6 para conocer la estructura.

B. ¿Cómo se regula el nivel de cAMP? ¿Qué hace?

1. ¿Cómo se fabrica el cAMP?

una. AMPc hecho de ATP por adenil ciclasa consulte el folleto y la fig. de Becker. 14-6 o Sadava fig. 7,12 (7,14).

B. ¿Qué activa la enzima adenil ciclasa? La proteína G activa la adenil ciclasa (también llamada adenilil ciclasa o AC)

2. ¿Qué hace cAMP? Consulte la tabla 14-1 de Becker y el folleto 13C.

una. AMPc se une y activa la proteína quinasa A = PKA . (También llamado Ccíclico ADependiente de MP pagrotein kinase = cAPK) Véase la fig. de Becker. 14-8.

B. PKA agrega fosfatos a otras proteínas

(1). Efecto de la fosforilación: La fosforilación por PKA puede activar o inhibir la proteína diana (diana = sustrato de PKA)

(2). Amplificación de la acción de PKA. La PKA activa puede modificar otras quinasas / fosfatasas y comenzar una cascada.

(3). El resultado final varía.Depende de qué quinasas y fosfatasas en ese tejido son objetivos (sustratos) de PKA y / o las otras quinasas / fosfatasas (al final de la cascada). Vea el ejemplo a continuación.

3. ¿Cómo se apaga el sistema de señales cuando sale la hormona?

una. El AMPc existente es de corta duración - se hidroliza por la fosfodiesterasa (PDE) a 5 'AMP ordinario.

B. Se detiene la síntesis de AMPc nuevo (cuando se elimina la señal). AC se vuelve inactivo.

(1) La proteína G no permanece activada por mucho tiempo: La proteína G activada hidroliza su propio GTP & # 8594 GDP (& # 8594 proteína G inactiva).

(2) La proteína G inactivada ya no activa la CA.

C. En ausencia de cAMP, la acción de las quinasas se detiene y / o se invierte.

(1) PKA se inactiva

(2) Las fosfatasas se activan - eliminar los fosfatos añadidos por las quinasas, revirtiendo el efecto PKA.

C . ¿Cómo funcionan las hormonas a través del cAMP? (ver también el folleto 14A, panel central)

1. La ruta del ligando y la PKA # 8594 es la misma *. Los pasos son los siguientes:

una. El ligando (hormona u otro) se une al receptor y lo activa.

B. El receptor activado activa la proteína G.

C. La proteína G activa la adenil ciclasa. (Pero vea la nota en *.)

D. La adenil ciclasa cataliza la producción de AMPc

mi. cAMP activa PKA

F. La PKA fosforila las proteínas diana.

gramo. Los diferentes tejidos pueden responder de manera diferente a la misma hormona; consulte a continuación.

* Nota: Esto se aplica a las proteínas G que activan la adenil ciclasa. Existen múltiples proteínas G: algunas inhiben la adenil ciclasa y otras afectan a diferentes enzimas y causan (o inhiben) la producción de diferentes segundos mensajeros.

2. Ejemplo # 1: TSH - afecta la glándula tiroides.

una. ¿Por qué la TSH afecta solo a la tiroides? Solo la glándula tiroides tiene receptores de TSH.

B. Generación de segundo mensajero En resumen, la TSH desencadena la síntesis de AMPc

TSH (primer mensajero) se une activar GPCR en la membrana activar la proteína G en la membrana activar la enzima en la membrana (adenil ciclasa) generar una molécula pequeña (segundo mensajero) dentro de la célula = cAMP

C. Rol del segundo mensajero (cAMP): El AMPc activa la PKA La PKA fosforila (y activa) las enzimas necesarias para producir la hormona tiroidea.

acampar activar la proteína quinasa (PKA) en el citoplasma fosforilar enzimas diana estimular múltiples pasos en la síntesis y liberación de TH

D. Respuesta general: Hormona estimulante de la tiroides (TSH): promueve la liberación de la hormona tiroidea (TH) de la glándula tiroides. Se analizará con más detalle cuando hagamos un resumen de las principales hormonas.

3. ¿Por qué molestarse con todos estos pasos?

una. Amplificación. Muchos pasos implican ampliaciones. Por ejemplo, una molécula de adenil ciclasa activa puede generar muchas moléculas de cAMP y una molécula de PKA puede fosforilar muchas moléculas de sus enzimas diana. Para ver un ejemplo de las posibilidades de una cascada de amplificación, consulte la fig. De Becker. 14-3 o Sadava fig. 7,18 (7,20). Los dos textos coinciden en un alto nivel de amplificación, pero no en los números exactos.

B. El ejemplo clásico. El ejemplo habitual de este tipo de cascada de modificación es la degradación del glucógeno, estimulada por la hormona epinefrina (adrenalina), que es el ejemplo de la fig. De Becker. 14-3, y se explica con más detalle a continuación (ejemplo n. ° 2).

4. Ejemplo n. ° 2 - Epinefrina - efectos sobre la regulación del metabolismo del glucógeno:

una. ¿Cuándo se secreta la epinefrina? En respuesta a una crisis. Desencadena la reacción de "lucha o huida".

B. Historia: Este fue el primer caso de regulación por AMPc que se descubrió.

C. ¿Cómo actúa la epinefrina? La epinefrina se une a un receptor (GPCR) que activa la CA y esto desencadena la síntesis de AMPc y la activación de PKA.

D. La PKA fosforila muchas enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno. Efectos de la fosforilación:

(1). Las enzimas de la descomposición del glucógeno en glucosa-fosfato son estimulado.

(2). Las enzimas de la síntesis de glucógeno son inhibido.

(3). Si está interesado en los detalles, consulte la fig. De Sadava. 7.18 (7.20) o Becker figs.14-22 (14-25) & amp 6-17, o el folleto en http://www.columbia.edu/cu/biology/courses/c2006/handouts12/glycogen09.pdf.

mi. ¿Cuál es el resultado neto? El glucógeno se descompone para proporcionar energía para hacer frente a una situación estresante.

Pruebe los problemas 6-8 y 6-9.

  • El receptor actúa en combinación con otras proteínas para unirse a diferentes ERE: diferentes genes afectados.

  • El efecto de la unión a ERE no es necesariamente el mismo (inhibición frente a activación).

  • En el músculo, el lactato puede liberarse a la sangre.

  • En el hígado, la glucosa se puede liberar a la sangre.

  • ¿Por qué el resultado es diferente? El hígado contiene fosfatasa para G-6-PAG y el músculo no. (Las enzimas adicionales también difieren).

(4). Principio general - El efecto final depende de todas las proteínas presentes en la célula, no solo de los receptores o dianas inmediatas.

(5). Mecanismo de acción hormonal - El proceso regulado puede ser diferente: en el ejemplo n. ° 1, la transcripción se ve afectada en el ejemplo n. ° 2, la actividad de la enzima se ve afectada.

B. Diferentes hormonas pueden desencadenar lo mismo vía de señalización en la misma celda

(1). ¿Cómo? Epi. (Epinefrina) y glucagón se unen a diferentes receptores, pero ambos receptores activan la misma proteína G y desencadenan la misma serie de eventos & # 8594 cAMP & # 8594 etc., por lo que pueden obtener la misma respuesta a ambas hormonas en mismo tejido (si ambos receptores están presentes).

(2). ¿Por qué? Dos hormonas controlan el mismo proceso (metabolismo del glucógeno) para diferentes propósitos - Epi para responder al estrés glucagón para responder a niveles bajos de azúcar en sangre (mantener la homeostasis - detalles a continuación o la próxima vez).

Pregunta: Dado que ambas hormonas desencadenan la misma vía, ¿responderá cualquier célula que responda a una hormona a la otra hormona?

Pruebe el problema 6-11.

IV. Introducción a la fisiología y los organismos multicelulares: ¿para qué sirve la señalización? ¿Por qué necesita epinefrina, glucagón, TSH, etc.?

A. Estilo de vida unicelular frente a multicelular

1. Organismos unicelulares

una. Rodeado externo medio ambiente -- Hipocresía cambiarlo o regularlo

B. Tengo uno Función básica - crecer y multiplicarse

C. Responder a condiciones externas (ya que no se pueden cambiar) para mantener un estado intracelular óptimo

(1). Recoger y / o tirar lo necesario para el metabolismo.

(2). Mantener las condiciones intracelulares(pH, nivel de aminoácidos, oxígeno, etc.) lo más constante posibley gastan un mínimo de energía ajustando las tasas de transcripción, actividad enzimática, etc.

D. Nota sin especialización: cada celda hace todas las funciones posibles

2. Organismos multicelulares y homeostasis

  • plasma = parte líquida de la sangre = líquido entre las células sanguíneas

  • líquido intersticial (IF) = líquido entre todas las demás células

C. Cada celda tiene dos funciones básicas

(1). Crecer o mantenerse como arriba

(2). Rol especializado en el mantenimiento de la homeostasis de todo el organismo

D. Las celdas son Especializado. El mantenimiento de la homeostasis requiere la cooperación de muchos tipos de células diferentes, no solo circuitos dentro de una sola célula.

Organismos unicelulares Organismos multicelulares
¿Qué rodea a la celda? Ambiente externo Entorno interno del organismo
¿Puede el organismo regular lo que rodea a cada célula? No
¿Cuántas funciones tiene cada celda? 1 2 o más
¿Está la célula especializada? No

B. Organización - ¿Cómo se configuran las células para cooperar en un organismo multicelular?

1. Células, tejidos y los 4 tipos principales de tejidos (5, si cuenta la sangre por separado) - vea la lección # 4, y los higos de Sadava. 40,3 a 40,6.

2. Órganos

una. Consiste en más de un tipo de tejido.

B. Ejemplo: Revestimiento del tracto gastrointestinal. (Haga una demostración ahora o la próxima vez). El revestimiento tiene capas de diferentes tejidos: epitelial, conectivo, muscular y nervioso. Estos tejidos sirven principalmente para la absorción (de material de la luz), soporte, contracción y regulación, respectivamente. (Ver Sadava fig. 40.7) La sangre (un tipo de conectivo) no encaja realmente en esta clasificación - sirve para el transporte de materiales hacia adentro y hacia afuera.

3. Sistemas - Grupo de órganos y # 8594 cuerpo o sistema de órganos. Trabajen juntos para mantener la homeostasis de algún componente. El número de sistemas depende de quién está contando. El número habitual es 8-12.

una. Sistema inmune - responde principalmente a cambios internos provocados por la presencia de organismos extraños (o sus macromoléculas) - responde a virus, bacterias, células cancerosas, etc. (rechazo de injertos, alergia, etc. son efectos secundarios de esto).

B. Otros sistemas - responder a cambios en el mileu interno provocados por otros factores.

C. Consecuencia de la multicelularidad: ¿cómo se produce la cooperación de las partes (tejidos, órganos, sistemas, etc.)? Necesita señalización para mantener la homeostasis.

IV. ¿Cómo se regula un componente del medio interno?

A. Principio general: la homeostasis se mantiene mediante la retroalimentación negativa

  • En fisiología, la retroalimentación negativa y positiva se definen como anteriormente. Para fb negativo, no importa si las correcciones se logran por inhibición (apagar el calentador para detener la producción de glucosa) o aceleración (encender el aire acondicionado, aumentar la absorción de glucosa de la sangre).

  • En bioquímica, la retroalimentación negativa generalmente significa inhibición de un paso anterior (& amp positivo fb generalmente significa activación).

  • En el habla inglesa normal, los comentarios positivos y negativos se utilizan de una tercera forma. Fb positivo significa comentarios positivos y complementarios, mientras que fb negativo significa comentarios críticos y negativos. Fb positivo significa que al oyente le gustó el fb negativo. significa que no lo hizo.

  • 'Efector' también se usa de manera diferente en fisio y bioquímica, ver más abajo.

B. Ejemplo # 1 - Regulación de los niveles de glucosa en sangre. La vista de balancín. Consulte el folleto 14B o la fig. De Sadava. 51,17 (51,18). La fig. en la novena edición no es un sube y baja, pero el punto es el mismo.

1. Tener una variable regulada - nivel de glucosa en sangre.

2. Necesita un sensor (o receptor) - para medir niveles de "variable regulada" (glucosa). Aquí, el sensor está en el páncreas.

3. Necesita efector (es) - para controlar los niveles de la variable regulada (glucosa) - suelen tener uno o más efectores que responden de forma opuesta. En este caso, los efectores de la captación de glucosa son el hígado, el tejido adiposo y el efector del músculo esquelético para la liberación de glucosa es el hígado.

Nota sobre la terminología: en fisiología, & quotefector & quot normalmente significa & quota tejido u órgano (como músculo o hígado) que lleva a cabo una acción y, por lo tanto, produce un efecto ''. En este ejemplo, los efectores = órganos que actúan para aumentar o disminuir la glucosa en sangre. En biología molecular, el término & quot; factor de cotización & quot se usa generalmente para significar & modulador de cuota de la función de la proteína & quot. Un modulador = una molécula pequeña (como un inductor, activador enzimático, etc.) que se une a una proteína, altera la forma y / o función de la proteína, y por lo tanto desencadenantes Un efecto.

4. Tener un punto de ajuste - el nivel que debe tener la variable regulada (glucosa en sangre). El punto de ajuste también se usa a veces para referirse al nivel en el que se activan las correcciones (para aumentar o disminuir el valor).

En la mayoría de los casos, no existe una diferencia significativa entre estas dos definiciones de punto de ajuste. En algunos casos, el valor deseado (primera definición) y el valor en el que se producen las correcciones (segunda definición) pueden ser diferentes. Por ejemplo, puede haber dos puntos de corte, superior e inferior, que delimitan el nivel deseado de una variable regulada. En niveles por encima o por debajo de los respectivos puntos de corte, se envían mensajes a los efectores apropiados para que tomen medidas correctivas. El término "valores críticos" se utiliza a veces en lugar de "puntos de ajuste" para describir los puntos de corte.

5. Señalización - Necesita algún sistema de señal para conectar los sensores y los efectores. Puede ser nervioso y / u hormonal. En este caso, la señal primaria (pero no la única) es hormonal y las hormonas primarias (señales) son insulina y glucagón.

6. Funcionamiento de la retroalimentación negativa - el sistema responde a negar desviaciones del punto de ajuste. Características importantes:

una. Funciona para estabilizar los niveles de glucosa en sangre. (la variable regulada)

B. El sistema se autocorrige - Se corrigen las desviaciones en cualquier dirección (si la glucosa en sangre es demasiado alta o demasiado baja).

C. Hay dos acciones opuestas de los efectores, no solo una.

(1). Si [G] aumenta demasiado, los efectores toman G de la sangre. (mitad superior del diagrama de balancín)

(2). Si la sangre [G] baja demasiado, el efector libera G a la sangre. (mitad inferior del diagrama de balancín)

D. Importante: la retroalimentación negativa no siempre es inhibición. En la retroalimentación negativa, las desviaciones del punto de ajuste se pueden corregir acelerando un proceso (como la absorción de glucosa) o ralentizando un proceso (como la descomposición del glucógeno en glucosa). Por lo tanto, la desviación del punto de ajuste en cualquier dirección puede arreglarse acelerando, no inhibiendo, un proceso. Por ejemplo:

(1). Si la sangre [G] sube, la captación de sangre aumenta. En este caso, un aumento en la captación de glucosa se utiliza para ayudar disminución la desviación del punto de ajuste. (Tenga en cuenta que este problema también se puede solucionar mediante decreciente degradación del glucógeno.)

(2). Si cae sangre [G],la liberación a la sangre aumenta. En este caso, un aumento en la liberación de glucosa se utiliza para ayudar disminución la desviación del punto de ajuste. (Tenga en cuenta que este problema también se puede solucionar mediante decreciente síntesis de glucógeno.)

(3). En ambos casos, ya sea que la desviación sea positiva o negativa (por encima o por debajo del punto de ajuste), la desviación se puede reducir aumentando un proceso o inhibiendo otro.

7. Resultado neto - La variable regulada ([G] en sangre) no es constante, pero permanece cerca del punto de ajuste.

Consulte el problema 5-1 y amp 5-2 a y amp b.

C.Ejemplo n. ° 2: Regulación de la temperatura corporal (en humanos): la vista del balancín (folleto 14B)

1. Tenga en cuenta que muchas características son las mismas que en el caso de la glucosa. (¿Puedes enumerarlos?)

2. Características que no se encuentran en la caja de glucosa:

una. Múltiples sensores en diferentes lugares. (para temperatura del núcleo y de la piel) ¿Cómo integrar múltiples entradas?

B. Naturaleza de la señal - Las señales son neuronales, no hormonales.

C. Centro integrador (IC) = termostato en Sadava fig. 40.2 (décima ed)

(1). Papel de IC: Compara el punto de ajuste con el valor real, envía el mensaje apropiado a los efectores.

(2). Tipo de CI

(a). La función de sensor / IC puede combinarse, como en el ejemplo de glucosa.

(B). Se necesita un IC separado si hay varios sensores, como en este caso. IC coordina la información entrante de múltiples sensores

(3). En este ejemplo, IC = hipotálamo (HT)


Apoptosis y cáncer

Una función principal de la apoptosis es destruir las células que son peligrosas para el resto del organismo. Una razón común para la apoptosis es cuando una célula reconoce que su ADN está muy dañado. En estos casos, el daño del ADN desencadena las vías de apoptosis, lo que garantiza que la célula no se convierta en un cáncer maligno.

Sin embargo, es evidente que este proceso a veces falla. Todos los casos de cáncer son presumiblemente casos en los que una célula dañada no cometió apoptosis, sino que siguió desarrollándose a sí misma.

Es posible que la apoptosis no pueda ocurrir si los genes esenciales necesarios para ella se encuentran entre los que están dañados. Sin embargo, algunos médicos y científicos han estado estudiando la apoptosis intensamente con la esperanza de poder aprender a desencadenarla específicamente en las células cancerosas mediante el uso de nuevos medicamentos u otras terapias.

Al igual que con todos los medicamentos diseñados para matar las células cancerosas, el desafío con los medicamentos diseñados para inducir la apoptosis es garantizar que estos medicamentos solamente efecto sobre las células cancerosas. Un medicamento que hace que las células sanas y las cancerosas cometan la muerte celular programada podría ser muy peligroso.

La imagen también puede no ser tan simple como "el cáncer ocurre cuando falla la apoptosis". La investigación ha sugerido que algunos cánceres pueden surgir en poblaciones de células donde la apoptosis ocurre más fácilmente de lo que debería, posiblemente estas células se hayan visto obligadas a "aprender" a ignorar las señales de apoptosis demasiado entusiastas y, posteriormente, no cometan apoptosis incluso cuando han sufrido una apoptosis grave. daño.

Otra investigación ha revelado que las células cancerosas que mueren debido a los efectos de la medicación a menudo mueren por apoptosis, lo que sugiere que los cánceres que son especialmente resistentes a la apoptosis también pueden ser especialmente resistentes al tratamiento.

Se necesita mucha más investigación sobre el tema del tratamiento del cáncer, y comprender las vías de la apoptosis es una vía extremadamente prometedora para lograr nuevos avances.


Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) desempeñan un papel integral en la transducción de señales de una enorme variedad de fenómenos biológicos, por lo que sirven para modular a nivel molecular casi todos los componentes de la biología humana. Este papel no es más evidente en ninguna parte que en la biología cardiovascular, donde los GPCR regulan medidas centrales de la función cardiovascular como la frecuencia cardíaca, la contractilidad y el tono vascular. La interacción GPCR / ligando inicia cascadas de transducción de señales y requiere la presencia del receptor en la membrana plasmática. La localización de la membrana plasmática es a su vez una función de la entrega de un receptor y su eliminación de la superficie celular, un concepto definido más ampliamente como tráfico de receptores. Esta revisión ilumina nuestra visión actual del tráfico de GPCR, particularmente dentro del sistema cardiovascular, y también destaca el hallazgo reciente y provocador de que los componentes de la maquinaria de tráfico de GPCR pueden facilitar la señalización de GPCR independientemente de la activación de la proteína G.

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) son mediadores centrales de casi todos los aspectos de la biología cardiovascular. Los GPCR se identificaron originalmente como receptores capaces de acoplarse a proteínas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) específicas, transduciendo así una señal extracelular a un efector intracelular, aunque más recientemente, se ha demostrado que varios GPCR emiten señales a través de mecanismos independientes de la proteína G tanto en vitro e in vivo. 1 Como familia de proteínas, los GPCR comparten características estructurales comunes, incluidos siete dominios que atraviesan la membrana y, por lo tanto, se denominan alternativamente receptores 7-transmembrana. Los GPCR son la superfamilia más grande de receptores de superficie celular y representan aproximadamente el 2% del genoma humano. 2 Además, los ligandos dirigidos a los GPCR (principalmente agonistas y antagonistas) representan la familia más grande de agentes farmacológicos, y representan casi el 30% de los agentes farmacéuticos clínicos disponibles actualmente. 3 Tanto las hormonas como los neurotransmisores ejercen sus efectos sobre el sistema cardiovascular a través de los GPCR. Ejemplos de GPCR con funciones bien atribuidas en biología cardiovascular incluyen la β1- y β2-receptores adrenérgicos (AR), el α1- y α2-ARs, la M2- y M3-receptores de acetilcolina muscarínicos, los receptores de angiotensina II (Ang II), los receptores de endotelina, el receptor de adenosina, el receptor de trombina y el receptor de vasopresina.

Durante las últimas casi 3 décadas, una gran cantidad de información ha revelado mucho sobre las propiedades de señalización de esta familia de siete receptores que atraviesan la membrana. Gran parte del trabajo se ha centrado en revelar las formas en que los GPCR regulan moléculas efectoras discretas, incluidas la adenilil ciclasa, las fosfolipasas y los canales iónicos. Aún más trabajos han arrojado luz sobre los mecanismos por los cuales se regula la señalización de GPCR y han conducido al descubrimiento de proteínas adicionales, incluidas las proteínas GPCR quinasas (GRK) 4,5 y β-arrestina, 6,7 que fosforilan respectivamente los GPCR activados por agonistas y se unen a los GPCR fosforilados para interrumpir físicamente la interacción entre el receptor y la proteína G, lo que conduce a la desensibilización de la activación de la proteína G mediada por el receptor. Además de su papel en la desensibilización de GPCR, la unión de la β-arrestina también promueve la translocación del citosol a la superficie celular de los componentes de la maquinaria endocítica, a saber, la proteína adaptadora 2 (AP-2) 8 y la clatrina, lo que facilita la eliminación del receptor del plasma. membrana.

Aunque todavía es sustancial, comparativamente menos trabajo se ha centrado en el tráfico de GPCR, gran parte de él relacionado con los mecanismos que regulan la endocitosis de los GPCR de la superficie celular, incluido el papel de la β-arrestina en la facilitación de la endocitosis de GPCR como se indicó anteriormente. De hecho, el suministro apropiado de GPCR a la superficie celular para permitir interacciones receptor / ligando, y su posterior recuperación de la membrana plasmática, son de fundamental importancia para la regulación de la actividad de GPCR. Esta revisión destaca nuestra comprensión actual del movimiento de GPCR desde la síntesis en adelante, con especial énfasis en los estudios de GPCR del sistema cardiovascular. Por último, discutimos la importancia del papel recientemente reconocido que el propio tráfico de GPCR puede tener en la señalización celular, incluido el papel recientemente reconocido y en expansión de las β-arrestinas en la señalización de GPCR independientemente de las proteínas G.

Tráfico de GPCR: postraducción

Tanto durante la síntesis como después de la misma, las proteínas de membrana, incluidos los GPCR, experimentan un proceso continuo de maduración antes de alcanzar su residencia en la membrana plasmática. Deben insertarse correctamente en la membrana (un proceso que se cree que ocurre de manera cotraduccional para la mayoría de las proteínas de membrana), lograr un plegado adecuado mientras aún residen en el retículo endoplásmico, atravesando el cis- al trans-Golgi mientras se someten a modificaciones, y finalmente se dirigen a la membrana plasmática donde alcanzan su residencia como proteínas maduras. Esta sección discutirá varios aspectos de este proceso de maduración que se han determinado para los GPCR (Figura, A).

Modelo general de tráfico de GPCR. A, Después de la síntesis, los GPCR residen inicialmente en el RE, donde se procesan y se pliegan guiados por proteínas acompañantes y de control de calidad. Dentro del RE, es probable que muchos GPCR formen estructuras homo o heterodiméricas. Después de la salida del ER, los GPCR transitan a través del aparato de Golgi, donde pueden sufrir modificaciones adicionales, como el procesamiento de oligosacáridos. En el borde distal del aparato de Golgi, los GPCR se empaquetan en vesículas de transporte exocítico y entran al sistema endosómico, donde posteriormente se dirigen a la membrana plasmática. Se han identificado múltiples proteínas, como se enumera, que afectan la estabilidad de GPCR en la superficie celular. ERAD indica degradación asociada a ER. B, Aunque se han descrito variaciones, la endocitosis por GPCR de la membrana plasmática ocurre con mayor frecuencia de una manera dependiente de GRK y β-arrestina. La unión del ligando promueve la fosforilación mediada por GRK de la superficie citoplásmica de GPCR y la posterior translocación de β-arrestina y la unión al receptor. La unión de β-arrestina, a su vez, facilita el reclutamiento posterior de AP-2 y la inclusión de clatrina y GPCR en CCP antes de la endocitosis a través de CCV. C. Después de la endocitosis, los GPCR pueden reciclarse a la membrana plasmática o clasificarse para la degradación lisosomal. La familia Rab de pequeñas GTPasas es integral para determinar el destino de un GPCR, mientras que se ha demostrado más recientemente que SNX1 desempeña un papel en la clasificación de GPCR endosomal a lisosomal. La ubiquitinación del receptor también juega un papel en la degradación del receptor a través de los lisosomas. D, Más recientemente, se ha demostrado que varios GPCR son capaces de señalizar a través de vías dependientes de β-arrestina. Cascadas de señalización dependientes de β-arrestina bien caracterizadas que se han descrito incluyen la activación de tirosina quinasa no receptora dependiente de agonistas, así como la activación de la vía de señalización MAPK.

Plegables y acompañantes

Los estrictos mecanismos de control de calidad dentro de las células aseguran que las proteínas plegadas de manera incorrecta o incompleta sean el objetivo de la degradación, generalmente a través de la vía del proteasoma. Para la mayoría de las proteínas nacientes estudiadas, el plegamiento en una conformación adecuada / funcional requiere la presencia de proteínas acompañantes endógenas accesorias. Los 10 GPCR no son una excepción a este proceso de control de calidad. Como ejemplo, la proteína DnaJ humana HSJ1b, un miembro de la familia de las cochaperonas citoplasmáticas de la proteína de choque térmico (HSP), regula el tráfico de rodopsina desde el retículo endoplásmico (ER) a la superficie celular. 11 Alternativamente, las proteínas chaperonas que atraviesan una sola membrana pueden facilitar la salida de GPCR del RE, como se demostró recientemente para el receptor similar al receptor de calcitonina, que debe formar un complejo heterodimérico con la proteína modificadora de la actividad del receptor (RAMP) antes de la salida del RE (revisado por Tan et al 12). Actualmente se desconoce si estas o proteínas acompañantes endógenas similares regulan el plegamiento de los GPCR importantes para algunos aspectos de la biología cardiovascular, pero ciertamente es posible dada la conservación estructural en esta gran familia de proteínas.

Sin embargo, a pesar de tales controles para garantizar que se produzcan errores de plegamiento de proteínas adecuados.Como tal, se han identificado una variedad de enfermedades humanas en las que las mutaciones que ocurren naturalmente dan como resultado el plegamiento incorrecto y / o la orientación errónea de una proteína mutante. Por tanto, se considera que tales enfermedades "conformacionales de proteínas" son el resultado de mutaciones que no afectan al dominio o dominios funcionales de la proteína mutante, sino que interfieren con el tráfico celular normal de la proteína (revisado por Bernier et al 13). Tales proteínas mal plegadas típicamente forman agregados que son perjudiciales para la célula o se reconocen como plegadas incorrectamente y, por lo tanto, se dirigen a la degradación por los mecanismos de control de calidad celular mencionados anteriormente (revisado por Sitia y Braakman 14). Curiosamente, trabajos recientes han demostrado que, en algunos casos, la manipulación química o farmacológica puede rescatar proteínas mal plegadas y conducir a su correcta translocación a la membrana plasmática donde las proteínas son funcionalmente activas.

La diabetes insípida nefrogénica (NDI) es un trastorno ligado al cromosoma X 15 con una incidencia en la población de aproximadamente 1 por 250 000. La NDI se caracteriza por la resistencia renal a la hormona antidiurética derivada de la hipófisis posterior (también llamada vasopresina arginina), un octapéptido que normalmente actúa en el receptor de vasopresina 2 (V2R) presente en las células epiteliales renales para permitir una concentración urinaria normal. 15 En pacientes con NDI y la ausencia completa de epitelio renal V2Expresión de la superficie de las células R, el volumen urinario diario puede superar los 15 L y provocar una muerte rápida. Más de 150 mutaciones diferentes en la V2Se han descrito R, la mayoría de los cuales (≈70%) deterioran V2Tráfico de superficie de células R (revisado por Bernier et al 13). La adición de una V permeable a las células2R antagonista de un subconjunto del mutante V2Las R que se habían demostrado previamente que se acumulaban en el RE dieron como resultado el plegamiento adecuado, la salida del RE, la orientación correcta a la superficie celular y el rescate funcional de la actividad del receptor de las proteínas mutantes. 16 Esto es presumiblemente atribuible a la capacidad del ligando de molécula pequeña para estabilizar el estado nativo de la proteína, facilitando así el tráfico adecuado del receptor. Los receptores 7-transmembrana mutantes adicionales que se sabe que tienen propiedades de tráfico alteradas que resultan en enfermedades humanas, y para los cuales se han identificado chaperonas moleculares, incluyen la rodopsina, el receptor 1 de sulfonilurea (SUR1), suavizado y el receptor de la hormona liberadora de gonadotropina (revisado por Bernier y col. 13). Sin embargo, queda por ver si el tratamiento farmacológico de las dianas de receptores mal traficadas identificadas anteriormente en los sistemas celulares se traducirá en una mejora de la enfermedad humana.

Oligomerización

Los primeros estudios que utilizaron los receptores de rodopsina 17,18 muscarínicos 19 y β-adrenérgicos 20 como modelo de GPCR sugirieron que los GPCR existen principalmente como monómeros, aunque la modificación de los sistemas de extracción de detergente utilizados para la purificación de proteínas llevó a los primeros investigadores a sugerir que una fracción variable de los GPCR también puede estar presente en forma oligomérica. 19,20 Muchos trabajos recientes que utilizan técnicas de transferencia de energía por coinmunoprecipitación y resonancia han demostrado de manera convincente que las estructuras diméricas de GPCR están presentes en la membrana plasmática y son el tema de varias revisiones recientes. 21-24 De hecho, se ha postulado que los GPCR homo y heterodiméricos pueden representar la unidad funcional básica necesaria para la mayoría, si no todas, las señales de GPCR (revisado por Park et al 25). Sin embargo, no se ha demostrado claramente si pueden formarse complejos oligoméricos de orden superior en la membrana plasmática, aunque el M2Se ha sugerido que el receptor -muscarínico es capaz de formar un trímero. 26

Sin embargo, no se aprecia ni se comprende bien el papel probablemente importante que desempeña la oligomerización de los GPCR en la biosíntesis y el tráfico de los GPCR nacientes a la superficie celular. De hecho, múltiples GPCR, incluido el β2-AR 27 y los receptores 28 de vasopresina experimentan una homodimerización constitutiva al principio de la vía biosintética, que probablemente ocurre en el RE. Expresión de β mutante2-Los AR construidos para carecer de un motivo de exportación de ER o para contener una señal de retención de ER heteróloga condujeron al atrapamiento de β de tipo salvaje2-AR en el ER, probablemente debido a la dimerización del receptor. 27 Es importante destacar que la adición de un péptido correspondiente al supuesto motivo de dimerización similar a la glicoforina en el sexto dominio transmembrana del β2-AR inhibió tanto la dimerización del receptor como el tránsito a la superficie celular. 29 Resultados similares en los que mutantes de la V2R 30 o la D2 Los receptores 31 de dopamina actúan como negativos dominantes para la expresión en la membrana plasmática de sus respectivos receptores de tipo salvaje, lo que sugiere que la oligomerización del receptor antes de la entrega a la superficie celular puede ser un mecanismo general por el cual se regulan múltiples miembros de la familia GPCR.

Además de la homodimerización, la heterodimerización temprana también juega un papel importante en el direccionamiento adecuado de algunos GPCR, como se demostró recientemente para el α1D-AR, que requirió heterodimerización con el α estrechamente relacionado1B-AR para la expresión de la superficie celular. 32 Estudios de inmunoprecipitación en los que β marcado con epítopo2-AR y Ang II tipo 1 (AT1) receptores (AT1Rs) se coexpresaron sugiriendo que los receptores pueden formar oligómeros antes de su localización en la membrana plasmática, ya que la cantidad de complejo receptor inmunoprecipitado no se vio afectada por la exposición a agonistas o antagonistas. 33 Estudios adicionales han demostrado el hallazgo inesperado de que la heterodimerización entre el β2-AR y un receptor olfatorio 34 o el α1D-AR 35 facilita la exportación de ER del receptor y la expresión en la superficie celular. Finalmente, expresión de la β2-AR junto con los receptores opioides δ y κ en células cultivadas conduce a la heterooligomerización de la β2-AR con el receptor opioide δ o κ en la membrana plasmática. 36 Curiosamente, esta asociación no afectó la unión del ligando o las propiedades funcionales de los receptores, pero sí alteró las propiedades de tráfico. En el δ-β2 células, los receptores δ se sometieron a β2-Internalización estimulada por agonistas AR y β2-AR sufrió endocitosis mediada por opioides, mientras que en κ-β2-Células AR, las β2-AR no se internalizó en respuesta a β2-Agonista AR u opioide. 36 Aunque este es un solo ejemplo, estos resultados sugieren que la heterooligomerización de GPCR puede ser una forma importante de modular el tráfico y la señalización de GPCR. Sin embargo, es importante señalar que en cada estudio de oligomerización descrito anteriormente, se realizó una sobreexpresión del receptor o receptores de interés y que tales alteraciones en el contenido del receptor celular pueden modificar las interacciones moleculares endógenas que ocurren en ausencia de sobreexpresión del receptor.

Por lo tanto, además del papel importante que desempeñan las chaperonas moleculares endógenas, como las proteínas de la familia HSP y RAMP, en el plegamiento de proteínas y la exportación ER de GPCR, es probable que la oligomerización de homo y heterorreceptores también desempeñe un paso crítico en la vía utilizada por al menos algunos GPCR. para el tráfico celular, aunque en la actualidad no está claro si la oligomerización después de la síntesis de proteínas es una vía general utilizada por todos los GPCR.

Estabilidad de la superficie celular

Para que un GPCR transduzca una señal extracelular, debe transitar correctamente y ser retenido en la superficie celular para permitir la interacción receptor / ligando. Se han identificado múltiples proteínas que no participan directamente en la cascada de transducción de señales que estabilizan la expresión de la superficie del receptor. Estos incluyen espinofilina, Homer, proteína de unión a actina 280 / filamina A, proteína 4.1N, muskelina y densidad postsináptica 95 (PSD-95) (revisado por Tan et al 12). De estos, PSD-95, una proteína de andamiaje que contiene múltiples dominios PDZ, ha demostrado de manera más concluyente que interactúa específicamente con un GPCR fundamental para la biología cardiovascular, a saber, el β1-ARKANSAS. Esta interacción ocurre a través del tercer dominio PDZ de PSD-95, que interactúa con el terminal carboxilo de la β.1-ARKANSAS. Curiosamente, la sobreexpresión de PSD-95 disminuyó la β1-AR internalización, pero no afectó la producción de cAMP estimulada por agonistas o la desensibilización del receptor, lo que sugiere un papel para PSD-95 en el mantenimiento de la β1-AR en la superficie celular. 37

Tráfico de GPCR: endocitosis

Mucho trabajo durante las últimas décadas ha iluminado nuestra comprensión actual de los mecanismos moleculares que subyacen a la eliminación de GPCR de la superficie celular. Fundamentales para este proceso son 2 familias de proteínas, las quinasas GPCR (GRK) y las arrestinas β, las cuales fueron identificadas inicialmente en estudios de desensibilización de GPCR y que están involucradas en la eliminación de GPCR activados por ligandos de la membrana plasmática. El trabajo adicional ha identificado un conjunto de proteínas accesorias, que interactúan con las clases de proteínas GRK y β-arrestina, y se han dedicado muchos esfuerzos recientes a delinear los detalles de estas múltiples interacciones que son inherentes al proceso de endocitosis de GPCR. Además, como se describirá a continuación, la ubiquitinación postraduccional inducida por agonistas tanto del receptor como de la β-arrestina desempeña papeles definitivos y discretos en la regulación del ciclo de vida de los GPCR (Figura, B).

Papel del microambiente lipídico en el tráfico de GPCR

La comprensión de la importancia del microambiente de lípidos de membrana para la señalización y el tráfico de GPCR está evolucionando rápidamente. Como ejemplo, recientemente se ha demostrado que tras la traducción, el AT1R requiere caveolina como acompañante molecular intracelular para el tráfico a la membrana plasmática. 38 Además, una vez en la superficie celular, está claro que algunos subconjuntos de GPCR se segregan preferentemente en regiones discretas de la membrana definidas como balsas lipídicas. 39-41 Los GPCR de importancia fundamental para la biología cardiovascular que se han localizado en balsas lipídicas y / o caveolas incluyen la adenosina A1, α1-AR, β1-AR, β2-UNA RATA1R, los receptores de endotelina (ETA-A y ET-B) y el M2-receptores muscarínicos. 42

Caveolae, un tipo específico de microdominio lipídico, representa para algunos GPCR el microambiente preferido para ciertos eventos como la señalización. Sin embargo, el mantenimiento de un receptor dentro de un microambiente específico puede estar sujeto a una regulación dinámica. De hecho, se han descrito modificaciones de GPCR reversibles, que incluyen tanto la unión covalente de un lípido al GPCR como la fosforilación de GPCR, que pueden desplazar el GPCR entre diferentes medios de membrana. Por ejemplo, se ha demostrado que una modificación lipídica reversible (p. Ej., Palmitoilación / despalmitoilación de residuos de cisteína) se dirige a los GPCR como el 5-HT1a receptor de balsas lipídicas. 43 Curiosamente, la endocitosis del β inducida por agonistas1-AR a través de hoyos recubiertos de clatrina (CCP) en células 293 de riñón embrionario humano (HEK) requiere la fosforilación de GRK del receptor, mientras que la endocitosis del β1-AR en balsas lipídicas / caveolas depende del receptor que se somete a la fosforilación de la proteína quinasa A. 44 Otra evidencia que apoya la importancia de la restricción del microdominio de la membrana de GPCR es que el confinamiento de la β2Se ha informado que la AR a caveolas es de importancia crítica para la regulación de la tasa de contracción intrínseca en preparaciones de membranas de miocitos cardíacos neonatales. 45 La importancia del microambiente de lípidos para el ensamblaje de andamios de señalización debajo de la interfaz GPCR / membrana también es un área de investigación activa y puede desempeñar un papel en múltiples aspectos del tráfico de GPCR, pero está más allá del alcance de esta revisión. Para una revisión más completa del papel del microambiente de lípidos en la señalización y el tráfico de GPCR, consulte varias revisiones excelentes recientes. 39,42

Internalización de GPCR dependiente de agonista versus independiente de agonista

La internalización del receptor después de la exposición a un agonista es una respuesta bien documentada para una amplia variedad de GPCR importantes para la biología cardiovascular. Como ejemplo, el GPCR prototípico, el β2-AR, se demostró inicialmente que se internaliza después de la exposición a un agonista, como se demuestra por la pérdida de unión a la superficie de un ligando de membrana no permeable. 46 Sin embargo, el uso de un ligando que permea la membrana demostró que la β2-AR todavía era accesible por ligando, lo que sugiere que el receptor estaba secuestrado en un compartimento intracelular después del tratamiento con agonista. 46 Alternativamente, mientras que la exposición del TA1R a Ang II conduce a la internalización del receptor y al secuestro endosómico, el receptor de Ang II tipo 2 (AT2R) no sufre endocitosis con la adición de Ang II, lo que demuestra que la clasificación e internalización de receptores específicos de subtipo puede ocurrir dentro del sistema cardiovascular GPCR. 47

La internalización de la mayoría de los GPCR se produce en el orden de minutos y se correlaciona con la fosforilación del receptor por parte de los GRK y la posterior translocación de β-arrestina, como se discutirá más adelante. De hecho, la β inducida por agonistas2La internalización del receptor -AR puede inhibirse por mutaciones del β2-AR, que inhiben la fosforilación de GRK inducida por agonistas 48 o por mutaciones en las proteínas β-arrestina. 49 Después de la internalización, los receptores pueden reciclarse a la superficie celular o dirigirse a la degradación lisosomal (revisado por Bohm et al 50).

También se ha examinado la internalización de GPCR en ausencia de agonista. Aunque las velocidades medias de internalización varían entre los receptores ensayados, las velocidades en general se reducen sustancialmente en ausencia en relación con la presencia del ligando análogo de un GPCR. El β2-AR, por ejemplo, sufre un secuestro de la superficie celular con una vida media de aproximadamente 10 minutos en presencia de agonista pero permanece en la superficie celular durante más de 1 hora en ausencia de agonista. 51

El papel de las proteínas accesorias en la endocitosis de los GPCR

La endocitosis de los GPCR puede ocurrir a través de caveolas, vesículas recubiertas de clatrina o vesículas no recubiertas. 52 Aunque los tramos lineales cortos de aminoácidos en los dominios citoplásmicos de los GPCR probablemente juegan un papel en su endocitosis, la mayoría del trabajo hasta la fecha ha demostrado que gran parte de la endocitosis de GPCR está regulada principalmente por GRK y procesos dependientes de β-arrestina que involucran clatrina pozos.

Quinasas GPCR

Como se muestra para múltiples GPCR, las GPCR quinasas específicas de serina / treonina (GRK) se reclutan después de la unión del agonista a la superficie citoplásmica del receptor activado, lo que conduce a la fosforilación del receptor. La superficie fosforilada del GPCR es entonces competente para servir como plataforma para la translocación del citosol a la membrana de las proteínas β-arrestina (revisado por Shenoy y Lefkowitz 53).

La familia de quinasas GRK está compuesta por 7 miembros que comparten una homología estructural y de aminoácidos significativa (revisado anteriormente 54,55). Dentro de esta familia, 4 quinasas (GRK 2, 3, 5 y 6) se expresan ampliamente y se cree que juegan un papel en la fosforilación de GPCR dentro del sistema cardiovascular. GRK2 y GRK3 residen en el citosol en ausencia de agonista y se trasladan a la membrana después de la estimulación con GPCR. La translocación de GRK2 / 3 y la localización de la membrana están mediadas en parte por su unión a las subunidades βγ de la proteína G heterotrimérica. 56 GRK5 y GRK6, por otro lado, están constitutivamente localizados en la membrana plasmática. Mientras que la palmitoilación de GRK6 es esencial para la asociación de la membrana, se cree que la localización de GRK5 en la membrana plasmática es atribuible a una interacción electrostática entre el extremo carboxilo muy básico de GRK5 y los fosfolípidos en la membrana plasmática. 58,59

Aunque la fosforilación específica de GRK de la superficie citoplásmica de los GPCR ocupados por agonistas media el reclutamiento de β-arrestina, las características estructurales comunes a los receptores activados que son reconocidos por los GRK siguen siendo en gran parte desconocidos. De hecho, es una cuestión de fundamental importancia cómo los miembros de este grupo limitado de GRK ampliamente expresados ​​son capaces de fosforilar una serie tan diversa de GPCR activados y de ese modo conducir al reclutamiento de β-arrestina.

Funcionalmente, se pueden definir 2 clases de GPCR, denominadas "clase A" y "clase B", basándose en la estabilidad relativa de la interacción GPCR / β-arrestina. Para el β2-AR (un receptor de clase A) y el receptor de vasopresina (un receptor de clase B), estos determinantes parecen estar presentes dentro de los terminales carboxilo de los receptores, como la estabilidad de su interacción con la β-arrestina, así como su capacidad para ser desfosforilado, reciclado y resensibilizado se invirtió completamente en los receptores mutantes en los que se intercambiaron sus colas carboxilo-terminales. 60

Curiosamente, mientras que los estudios in vitro han localizado sitios de fosforilación mediados por GRK2 y GRK5 de la β2-AR a la porción distal de la cola citoplásmica del receptor, 61 estudios más recientes en células intactas han sugerido que el agonista indujo β2La fosforilación de -AR se produce en la porción proximal del extremo carboxilo terminal del receptor. 62 Aunque el β observado2Se creía que la fosforilación de la cola proximal de -AR estaba mediada por GRK en lugar de la proteína quinasa A, esto no se confirmó. Por tanto, aunque la fosforilación mediada por GRK de los GPCR estimulados por agonistas subyace al reclutamiento de β-arrestina y, por lo tanto, inicia la endocitosis de GPCR en los CCP, quedan por determinar muchos de los detalles moleculares. En particular, un estudio reciente que utilizó interferencia de ARN de alto rendimiento implicó a los GRK como un papel más general en el proceso de endocitosis mediada por clatrina en sí. 63

Β-Arrestin como proteína adaptadora endocítica

Dentro de los seres humanos, existen 2 isoformas de las proteínas β-arrestina no visuales, a saber, β-arrestina1 y β-arrestina2, las cuales muestran una distribución tisular ubicua. Además de su función bien descrita en la limitación de la interacción entre el receptor y la proteína G, las proteínas β-arrestina también sirven para reclutar y conectar físicamente el receptor con la maquinaria endocítica. Experimentalmente, las mutaciones del receptor que alteran la fosforilación de GPCR inducida por agonistas limitan el reclutamiento de β-arrestina y conducen a una mala internalización del receptor, como se demostró para un β2-AR en el que se habían alterado todos los sitios de fosforilación de GRK. 48 Además, la expresión de proteínas β-arrestina mutantes "dominantes negativas" (tales como β-arrestina1 V53D o β-arrestina2 V54D) inhibe la β-arrestina2-Internalización AR. 64 Además, las propias proteínas β-arrestina pueden interactuar directamente con los componentes esenciales de la maquinaria de la cubierta de la vesícula recubierta de clatrina (CCV), a saber, el complejo heterotetramérico AP-2, 8 así como la clatrina, 9 y estas interacciones son crítico tanto para el reclutamiento de la β2-AR en fosas recubiertas de clatrina, así como para la internalización del receptor. Estudios con otros GPCR, incluido el α2-AR 65 y la A2B El receptor 66 de adenosina también ha mostrado papeles importantes para las β-arrestinas en la endocitosis del receptor.

Curiosamente, aunque las 2 isoformas de β-arrestina exhiben casi un 80% de identidad de aminoácidos, 6 no parecen desempeñar funciones biológicas redundantes y, de hecho, exhiben diferencias en su regulación. Mientras que la β-arrestina1 es fosforilada por enzimas quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), la 67 β-arrestina2 es fosforilada por la caseína quinasa II. 68 Sin embargo, para ambas proteínas β-arrestina, el estado de fosforilación / desfosforilación parece regular la capacidad de la proteína β-arrestina para promover la internalización de la β-arrestina2-AR a través de vesículas recubiertas de clatrina.

Como se señaló anteriormente, el análisis de la translocación de β-arrestina estimulada por agonistas para una variedad de GPCR sugiere que existen 2 clases de receptores en gran medida distintas con las que se asocian las β-arrestinas, denominadas GPCR de clase A y clase B. Después de la exposición a agonistas, los receptores de clase A, incluido el β2-AR, receptor de endotelina A y α1b-AR recluta preferentemente β-arrestina2. 69 Por el contrario, los receptores de clase B, incluido el AT1aR y V2 receptor, son capaces de unirse a ambas isoformas de β-arrestina con una afinidad casi igual. 70 Mientras que las interacciones del receptor de β-arrestina1 / 2-clase A ocurren únicamente en la membrana plasmática y se pierden después de la internalización de GPCR, las interacciones de β-arrestina1 / 2 con receptores de clase B son mucho más estables y pueden detectarse en las estructuras endosómicas después de la endocitosis del receptor (revisado por Pierce y Lefkowitz 71). Además, los receptores de clase A generalmente se reciclan a la membrana plasmática rápidamente, mientras que los GPCR de clase B se reciclan más lentamente. El papel de la ubiquitinación en la modulación de la interacción GPCR / arrestina es probablemente importante y se analiza a continuación. Los fibroblastos embrionarios de ratón generados para carecer de ambas isoformas de β-arrestina mostraron un marcado deterioro de la internalización estimulada por agonistas de la clase A β2-AR o la clase B AT1aR, mientras que solo β2La internalización de -AR se vio afectada por la deleción única de la isoforma β-arrestina2. 69 Los estudios que utilizan tecnología de interferencia de ARN para la ablación selectiva de las proteínas β-arrestina han mostrado resultados similares con respecto a la internalización de la β-arrestina2-AR y AT1-AR como modelo de receptores de clase A y B, respectivamente. 72

Ubiquitinación y clasificación de GPCR inducida por agonistas

Recientemente se ha demostrado que la modificación postraduccional de las proteínas del sustrato mediante la unión covalente de ubiquitina (ubiquitinación), originalmente descubierta en el contexto de la degradación de proteínas celulares, desempeña un papel no canónico en la regulación de la clasificación postendocítica de varias proteínas de membrana, incluidos los GPCR. 73,74 La ubiquitinación de proteínas está mediada por la acción concertada de 3 enzimas. Las 2 primeras enzimas (E1 y E2) son responsables, respectivamente, de activar la ubiquitina y escoltar a la ubiquitina activada. La tercera enzima, ubiquitina ligasa E3 (E3), reconoce y modifica el sustrato de manera oportuna. 75 Para la β2-AR, tanto la fosforilación mediada por GRK como la unión de β-arrestina son esenciales para que se produzca la ubiquitinación del receptor. 76 Es importante destacar que esta β estimulada por agonistas2La modificación de ubiquitinación -AR es necesaria para que el receptor sufra degradación en lisosomas. Además, la degradación lisosomal dependiente de ubiquitina es aplicable a otros GPCR como V2R y el receptor 2 activado por proteasa (PAR2). 77,78 Tanto para la β2-AR y V2La ubiquitinación del receptor R requiere las proteínas β-arrestina. Aunque la naturaleza de este requisito no está del todo clara, una suposición es que las β-arrestinas pueden servir como adaptadores para llevar ligasa (s) E3 aún no identificadas a los receptores de una manera dependiente del estímulo. En el caso de los receptores PAR2 y CXCR4, la ubiquitinación está mediada por las ligasas E3 c-Cbl 78 y AIP4, 79 respectivamente, pero aún no se ha demostrado la participación de las β-arrestinas.

Para los GPCR de mamíferos anteriores, así como para otros tales como el receptor de quimiocina CXCR4, la ubiquitinación del receptor 80 no es necesaria para la internalización per se, pero es crucial para la clasificación de los receptores ubiquitinados a lisosomas. Un estudio reciente de la β1-AR en un sistema celular heterólogo informó la resistencia de la proteína receptora a la ubiquitinación, así como a la degradación mediada por agonistas, lo que sugiere una fuerte relación entre la modificación de este receptor y las vías de regulación a la baja. 81

Mientras que se sabe que la degradación de GPCR y otras proteínas de membrana ocurre en los lisosomas, la de algunos receptores de membrana, como el receptor de eritropoyetina que atraviesa una sola membrana, involucra tanto a los lisosomas como a los proteasomas 26S, los complejos de megaproteasas que degradan la mayoría de las proteínas celulares. 82 Es interesante, sin embargo, que un informe reciente sugiere que la ubiquitinación y la degradación proteasomal de A intracelular recién sintetizado2A Los receptores de adenosina sirven como método de control de calidad de ER (Figura, A). Es importante destacar que esta degradación podría superarse mediante la coexpresión de USP4, una enzima deubiquitinante que pertenece a una familia de enzimas que catalizan la eliminación de ubiquitina de los sustratos modificados. 83 La expresión de la USP4 condujo a una expresión funcional más robusta de la A2A receptor en la membrana plasmática, lo que sugiere que la desubiquitinación puede facilitar el direccionamiento de las proteínas de la membrana a la superficie celular (Figura, A).

Por otro lado, la internalización de GPCR puede ser regulada por la ubiquitinación dependiente de agonistas de β-arrestina por la ligasa E3 Mdm2, como se demostró para β2-ARKANSAS. 76 Además, la estabilidad de la unión de β-arrestina / GPCR que define a los GPCR como clase A o B (como se describió anteriormente) también se correlaciona con el estado de ubiquitinación de las proteínas de β-arrestina. La separación de la β-arrestina de los GPCR de clase A resulta de la desubiquitinación rápida de la β-arrestina, mientras que la interacción más estable de la β-arrestina con los receptores de la clase B es causada por la ubiquitinación sostenida de la β-arrestina. 84 Como se describirá a continuación, la ubiquitinación de la β-arrestina parece no solo ser capaz de regular las propiedades de tráfico de GPCR, sino que probablemente también desempeña un papel importante en la dirección de los eventos de señalización aguas abajo.

Clasificación de señales utilizadas para el tráfico intracelular y la endocitosis de GPCR

La identificación de señales de aminoácidos lineales y cortas presentes en los dominios intracelulares de las proteínas transmembrana responsables de mediar la clasificación intracelular y la endocitosis de una proteína transmembrana de la membrana plasmática ha sido el foco de mucho trabajo durante las últimas dos décadas. Se cree que tales secuencias actúan como sitios de reconocimiento para componentes de la maquinaria de la proteína adaptadora celular necesaria para el tráfico de proteínas intracelulares. La importancia de tales señales contenidas dentro de los dominios intracelulares de los GPCR, sin embargo, está menos descrita que la de otras proteínas transmembrana. Aunque limitado en número, se han delineado excepciones al paradigma general de endocitosis mediada por GRK / β-arrestina para los receptores de siete membranas importantes para el sistema cardiovascular. Curiosamente, los motivos mejor descritos son análogos a los utilizados por los receptores transmembrana no GPCR e incluyen motivos basados ​​en di-leucina (LL o LXL) y basados ​​en tirosina (NPXY o NPXXY o YXXO).

Como prototipo de GPCR, el β2-AR contiene un motivo de di-leucina dentro de su terminal carboxilo, cuya alteración no afecta la capacidad del receptor para transitar correctamente a la superficie celular, unirse al agonista o activar la adenilil ciclasa. Sin embargo, la adición de agonistas no conduce a la internalización de este β mutante2-AR, 85 demostrando un papel para el motivo di-leucina del β2-AR en endocitosis de receptores inducida por agonistas. De manera similar, las mutaciones introducidas en el motivo de leucina en la cola citoplasmática del receptor de vasopresina 1a (V1aR) internalización del receptor inducida por agonistas significativamente deteriorada. 86 Curiosamente, sin embargo, la mutación del motivo análogo di-leucina en el V2R resultó en un receptor que no pudo escapar del ER, lo que sugiere un papel para este motivo en V2R maduración. 87

También se ha demostrado que las señales de clasificación basadas en tirosina son necesarias en el tráfico de β2-ARKANSAS. Mutación de Y326 en el β humano2-AR, ubicado en la unión propuesta del séptimo dominio transmembrana y la porción proximal del término carboxilo y conservado en posición a través de muchos miembros de la gran superfamilia de GPCR, no afecta la capacidad del receptor para transitar correctamente a la célula de superficie, se unen al agonista o para activar la adenilil ciclasa cuando el receptor está sobreexpresado. 88 La mutación, sin embargo, abolió completamente la β2-Internalización inducida por agonistas AR. Sin embargo, esta interpretación fue complicada por el hallazgo de que los niveles de expresión más bajos de β mutante2-AR dio como resultado la pérdida de la unión del ligando y el acoplamiento de la adenilil ciclasa, probablemente debido a la retención intracelular del receptor mutante. 89 Más recientemente, un motivo basado en tirosina altamente conservado (YXXO) en la cola citoplasmática del receptor 1 activado por proteasa (PAR1), un GPCR para trombina, que previamente se había demostrado que experimentaba internalización independiente de β-arrestina, fue demostrado ser necesario para la internalización mediada por agonistas pero no constitutiva. 90 Finalmente, estudios más recientes han demostrado una interacción directa entre un tramo de 8 argininas contenidas en el terminal carboxilo del α1b-AR y la subunidad AP-2 μ. 91 Si el motivo alternativo basado en tirosina encontrado en PAR1 o el motivo arginina no clásico identificado en el α1b-AR juega un papel en la endocitosis y el tráfico intracelular de otros GPCRs clásicamente identificados como fundamentalmente importantes para el sistema cardiovascular aún no se ha determinado.

Papel de las proteínas adicionales en la endocitosis de los GPCR

Además de las funciones bien reconocidas de las proteínas GRK y β-arrestina en la internalización de GPCR, se ha demostrado que muchas otras proteínas son importantes en el proceso endocítico. A continuación se analiza una lista parcial y una descripción del papel que juegan estas proteínas en la endocitosis de GPCR.

Factor 6 de ADP-ribosilación

El factor de ribosilación de ADP 6 (ARF6) es un miembro de la familia ARF de pequeñas proteínas de unión a GTP que se sabe que son actores clave en los eventos de tráfico vesicular. Además de su papel en la unión de AP-2 y clatrina, la β-arrestina también puede unirse directamente a ARF6 y modular su actividad. La activación de ARF6 requiere el intercambio de GTP por GDP, una reacción que es catalizada por el factor de intercambio de nucleótidos de guanina ARF (GEF) ARNO (sitio de unión de nucleótidos O pener de ARF). Es importante destacar que ARNO está constitutivamente asociado con β-arrestina2. 92 Como se muestra para la β2-AR, expresión de proteínas ARF6 mutantes que contienen sustituciones de un solo aminoácido que las vuelven deficientes en su capacidad para unirse (T27N) o hidrolizar (Q67L) β inducida por agonistas inhibidos por GTP2-Internalización AR. 92 Sin embargo, la sobreexpresión de ARNO solo aumenta la β2-Internalización de AR estimulando el intercambio de nucleótidos GTP en ARF. Por tanto, el reclutamiento de β-arrestina promovido por agonistas a un receptor activado conduce a la regulación local de la endocitosis por β-arrestina atribuible a su capacidad inherente para unirse tanto a ARNO como a ARF6.

Además de requerir una proteína GEF, las proteínas ARF también requieren una proteína activadora de GTPasa (GAP) para acelerar la hidrólisis del GTP unido. Inicialmente identificadas como proteínas que interactúan con GRK (GIT), GIT1 y GIT2 son proteínas que contienen dedos de zinc que funcionan como GAP para ARF6. 93,94 La sobreexpresión de GIT1 reduce la internalización de los receptores transmembrana en los CCP y CCV, incluido el β1- y β2-AR, el receptor de adenosina 2B y el M1-receptor muscarínico. 95 Es importante destacar que la actividad ARF-GAP de las proteínas GIT es estimulada por el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, mientras que otras ARF-GAP, como ARF-GAP1, son estimuladas por el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato y diacilglicerol. 94 Esto plantea la interesante posibilidad de que la regulación GIT de la actividad de ARF6 pueda integrarse mediante la activación de la vía de señalización de la fosfatidilinositol 3-quinasa.

Fosfatidilinositol 3-quinasa

Las 3-quinasas de fosfatidilinositol (PI3K) son una familia conservada de quinasas con actividad tanto de lípidos como de proteína quinasas que pueden activarse en respuesta a la estimulación de GPCR. Como familia, se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en una serie de funciones celulares tan divergentes como la supervivencia celular, la motilidad celular y la endocitosis del receptor. Dentro del citosol, PI3K forma un complejo constitutivo con GRK2. 96 Como se demostró para la β2-AR, la unión del agonista induce la translocación del complejo GRK / P13K al receptor activado, la formación de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato y el posterior reclutamiento de AP-2 y clatrina, lo que conduce a la endocitosis del receptor. Es importante destacar que la internalización del receptor se bloquea por la sobreexpresión de la porción de PI3K que media su interacción con GRK2, así como por la 3,4,5 trifosfato lípido fosfatasa PTEN específica, lo que demuestra la importancia de la actividad lípido quinasa de PI3K para la producción localizada. de fosfoinosítidos D-3 en la regulación de la endocitosis inducida por ligando del β2-ARKANSAS. 97

Como se señaló anteriormente, además de poseer actividad lípido quinasa, los miembros de la familia PI3K también pueden funcionar como proteína quinasas, aunque la importancia de esta actividad ha permanecido en gran parte oscura dado el número limitado de sustratos proteicos reconocidos por PI3K. 98 Recientemente, sin embargo, la importancia de la actividad de la proteína quinasa PI3K en la regulación de β2-Se ha iluminado la endocitosis AR. En un elegante estudio, Naga Prasad et al identificaron la proteína citoesquelética no muscular tropomiosina (una proteína de unión al filamento de actina) como sustrato para la isoforma γ de PI3K y demostraron además que PI3K puede fosforilar selectivamente un solo sitio (S61) dentro de la tropomiosina. 99 La alteración de este sitio dentro de la tropomiosina para imitar la fosforilación constitutiva (S61D) conduce a la complementación de una PI3K defectuosa en la proteína quinasa, mientras que el cambio a un residuo deficiente en fosfo (S61A) bloqueó la β inducida por agonistas.2-Internalización AR. Por lo tanto, a través de su actividad lipídica y quinasa, PI3K juega un papel central en la eliminación inducida por agonistas de la β2-AR, el modelo prototípico cardiovascular GPCR, de la superficie celular. Actualmente se desconoce si este paradigma se extenderá a otros miembros de la familia de GPCR cardiovasculares, pero parece probable, dado que la endocitosis a través de CCV que contienen AP-2 es el mecanismo predominante de internalización para la mayoría de los GPCR activados por ligando.

Tráfico intracelular: clasificación / reciclaje / degradación

Una vez internalizados desde la superficie celular, los GPCR se pueden clasificar a lo largo de múltiples vías (Figura, C). Pueden sufrir desfosforilación, resensibilización y reciclarse a la membrana plasmática. Alternativamente, los GPCR pueden dirigirse a la degradación a través de la ruta endosomal / lisosomal. Por último, se ha demostrado más recientemente que múltiples GPCR inician vías de señalización intracelular independientes de la proteína G después de la endocitosis, como se analiza a continuación. Estos múltiples destinos de tráfico para los GPCR internalizados son el tema de una excelente revisión reciente. 100 Nos gustaría destacar algunas proteínas importantes para estos procesos.

Factor regulador del intercambiador de Na + / H +

Después de la estimulación de los receptores adrenérgicos, se ha reconocido desde hace mucho tiempo que se producen cambios dependientes de la proteína G en el metabolismo celular, la excitabilidad y el crecimiento. 101 Asimismo, se han demostrado cambios celulares aparentemente independientes de la activación de la proteína G, incluyendo alteraciones en el pH celular a través de la regulación del intercambiador Na + / H +. Un trabajo reciente ha establecido que la estimulación agonista de la β2-AR promueve la asociación directa del extremo carboxilo terminal del receptor con el primer dominio PDZ dentro del factor regulador 1 del intercambiador de Na + / H + (NHERF1). 102 Se ha demostrado que ocurren asociaciones similares para otros GPCR que contienen secuencias que se ajustan al motivo consenso DS / TxL, incluido el receptor P2Y1 purinérgico y el CFTR, 103 mientras que otros GPCR, como el receptor 104 de la hormona paratiroidea, interactúan con ambos PDZ dominios de NHERF1 y NHERF2 a través de un motivo consenso PDZ ligeramente diferente (ETVM). Para el β2-AR, la interrupción de esta interacción altera notablemente los cambios inducidos por agonistas en el pH intracelular.

NHERF también es de importancia crítica para la clasificación intracelular adecuada de la β2-ARKANSAS. Además de su capacidad para unirse al extremo carboxilo terminal de la β2-AR a través de su dominio PDZ, NHERF puede, a través de su dominio ezrin-radixin-moesin (ERM), unirse al citoesqueleto de actina a través de la asociación con proteínas ERM. Es importante destacar que las mutaciones generadas para interrumpir la interacción de NHERF con el β2-AR carboxyl terminal o con proteínas ERM conducen a una degradación lisosomal significativa inducida por agonistas de la β2-AR después de la endocitosis, en lugar de reciclarse. 105 Como se señaló anteriormente, se ha demostrado que múltiples GPCR adicionales interactúan con las proteínas NHERF. Aunque se ha demostrado que el NHERF juega un papel en el reciclaje de otros GPCR como el receptor opioide κ (revisado por Liu-Chen 106), la generalización del papel que juega el NHERF en el reciclaje de otros GPCR, particularmente en el sistema cardiovascular , queda por determinar.

Norte-Proteína de fusión sensible a etilmaleimida

En un estudio para identificar compañeros de unión de β-arrestina, se descubrió que β-arrestina1 interactúa en ensayos de levadura 2 híbridos e in vitro con norte-proteína de fusión sensible a etilmaleimida (NSF), una ATPasa esencial para muchas funciones de transporte intracelular. 107 Además, la sobreexpresión de NSF en células HEK293 condujo a un aumento de β inducido por agonistas2-AR internalización y podría rescatar los efectos de un mutante β-arrestina1 (S412D) que previamente se demostró que funciona como un negativo dominante para β2-Internalización AR. Curiosamente, la β2-AR también puede, a través de su extremo carboxilo terminal, unirse directamente a NSF. 108 El β2-La interacción AR / NSF depende de agonistas y es un requisito para la eficacia de β mediada por agonistas2-Internalización AR. Es importante destacar que, mientras que β de tipo salvaje2-Los AR se reciclan a la superficie celular después de la exposición al antagonista propranolol, β2-Los AR que contienen mutaciones en sus extremos carboxilo distales permanecen secuestrados intracelularmente, lo que demuestra la importancia de la β2-Interacción AR / NSF para una β adecuada2-Reciclaje AR. Por tanto, aunque está claro que las proteínas que se unen a los extremos carboxilo terminales de los GPCR, como NHERF y NSF, sirven para regular la clasificación intracelular de los receptores como el β2-AR, queda por dilucidar hasta qué punto el tráfico de otros GPCR está modulado por estas o proteínas similares aún no identificadas.

Clasificación de Nexin 1

Después de la internalización, los GPCR pueden reciclarse a la membrana plasmática o someterse a clasificación en la ruta endosomal / lisosomal para su degradación. Aunque es fundamentalmente importante como mecanismo para la regulación a la baja de ciertos GPCR, como el PAR1, que reconoce la proteasa coagulante trombina, se sabe comparativamente menos acerca de los componentes moleculares que dirigen la clasificación postendosómica y el reciclaje de los receptores.

Aunque la clasificación de la nexina 1 (SNX1) se identificó originalmente como una proteína asociada a la membrana que interactúa con el receptor de tirosina quinasa, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y funciona en la clasificación de EGFR a los lisosomas, también se ha demostrado que 109 SNX1 interactúa con PAR1 en de una manera dependiente de agonistas. 110 La sobreexpresión de un mutante de deleción terminal carboxilo SNX1 no afectó significativamente la internalización y acumulación de PAR1 inducida por agonistas en endosomas tempranos, pero pudo impedir la clasificación de PAR1 de endosoma a lisosoma y, por lo tanto, inhibió marcadamente la degradación de PAR1. 110 Estudios adicionales, en los que el agotamiento de SNX1 endógeno en células HeLa a través de una pequeña tecnología de ARN interferente perjudicó notablemente la degradación de PAR1 inducida por agonistas, refuerzan la sugerencia de que SNX1 desempeña un papel en el tráfico intracelular de PAR1 desde endosomas a lisosomas. 111 Queda por determinar si SNX1 u otras proteínas SNX pueden mediar en la clasificación endosómica a lisosómica de GPCR distintos de PAR1, pero es ciertamente posible dada la conservación general de los temas de tráfico compartidos entre los miembros de esta gran familia de proteínas.

Rab GTPasas

Una segunda clase de proteínas que se ha demostrado que regulan el movimiento de los GPCR tanto durante como después de la endocitosis son las proteínas Rab, una familia de pequeñas proteínas de unión a GTP similares a Ras. Es importante destacar que diferentes miembros de la familia Rab GTPasa se asocian selectivamente con estructuras intracelulares específicas que incluyen tanto el reciclaje como la clasificación de endosomas, donde median múltiples pasos del tráfico de la membrana vesicular, incluida la gemación, el acoplamiento y la fusión de vesículas (revisado por Seachrist y Ferguson 112).

Dentro del sistema cardiovascular, Rab5 juega un papel central en la internalización mediada por CCV agonista dependiente y la localización endosómica temprana de algunos GPCR, incluido el β2-ARKANSAS. 113 Expresión de un Rab5 (S34N) negativo dominante bloqueado β2-AR internalización, mientras que un Rab5 constitutivamente activo (Q79L) no alteró significativamente β2-Internalización AR. Curiosamente, mientras que la β2-AR no puede asociarse directamente con Rab5, el AT1R se une a Rab5 directamente a través del extremo carboxilo del receptor y se localiza en estructuras endosomales que contienen Rab5 después de la endocitosis. 114 Además, la interacción de Rab5 con el AT1La R en los endosomas parece ser necesaria para prevenir la clasificación del receptor internalizado en lisosomas. 115 A diferencia de la internalización de la β2-AR, sin embargo, endocitosis del AT1R no parece depender de Rab5, 114, lo que demuestra la diversidad intracelular en las funciones de tráfico de GPCR desempeñadas incluso por miembros individuales de la familia de proteínas Rab.

Mientras que Rab5 juega un papel en los eventos de tráfico de GPCR asociados con la internalización de GPCR y / o la formación endosómica temprana, varios miembros adicionales de la familia Rab han sido implicados en otros eventos de tráfico de GPCR, incluidos Rab4 y Rab11 en el reciclaje de receptores, y Rab7 en la clasificación endosomal a lisosomal . 115 En un modelo de ratón transgénico en el que se sobreexpresaba un Rab4 (S27N) dominante negativo en el corazón, los ratones tenían una capacidad de respuesta alterada tanto a las catecolaminas endógenas como exógenas. 116 Además, cuando estos ratones se cruzaron con ratones que también sobreexpresaban una β humana específica para el corazón2-AR, los ratones resultantes tenían una β vesicular intracelular anormal2-Acumulación de AR, así como una reducción significativa de la contractilidad cardíaca. Dichos resultados sugieren que la regulación adecuada de β mediada por Rab42El reciclaje del receptor -AR es necesario para el mantenimiento de la capacidad de respuesta normal a las catecolaminas y la resensibilización del receptor. Actualmente se desconoce si Rab4 también juega un papel similar in vivo en el reciclaje de otros GPCR dentro del sistema cardiovascular. Para una revisión más completa de las diversas funciones que desempeñan los miembros de la familia de proteínas Rab en casi todos los aspectos del tráfico de GPCR, consulte varias revisiones excelentes recientes. 100,112

Otras proteínas con funciones en la endocitosis de GPCR y el tráfico postendocitótico

Se han identificado y caracterizado muchas proteínas adicionales que desempeñan funciones fundamentales en la endocitosis y el tráfico postendocítico de GPCR. Estos incluyen, pero no se limitan a, proteínas involucradas en la formación de CCV y la escisión de la membrana como AP-2, clatrina, dinamina, Hrs y GASP, 117-119, así como múltiples proteínas de andamiaje que se ha demostrado que interactúan con la β.1-AR incluyendo densidad postsináptica 95 (PSD95), 120 guanilato quinasa invertida asociada a membrana-2 (MAGI-2), 121 y las endofilinas. 122 Debido al alcance limitado de esta revisión, hemos optado por resaltar solo proteínas seleccionadas como se indicó anteriormente.

Internalización / Tráfico y señalización

Aunque los mecanismos de internalización que conducen al secuestro del receptor lejos de la fuente de estímulo se han considerado principalmente como vías de desensibilización de señales, ahora existe una gran cantidad de investigaciones que respaldan la señalización continua que se combina con la endocitosis de GPCR. 123 Además, aunque generalmente se cree que las "direcciones" endocíticas determinan el alcance de la señalización, los mecanismos de señalización continua durante el tráfico de proteínas pueden determinar la ruta endocítica exacta regulando procesos como la fusión de vesículas y la transferencia de carga. Como tal, es cada vez más evidente que los 2 procesos, tráfico y señalización, no solo están conectados, sino que probablemente están inextricablemente entrelazados (Figura, D).

En el caso de los GPCR, se ha demostrado claramente que la β-arrestina juega un papel esencial en la desensibilización de la señalización del segundo mensajero mediada por la proteína G. Más recientemente, sin embargo, también se ha demostrado que las proteínas β-arrestina facilitan la internalización del receptor a través de CCV, así como acoplan los receptores y activan las tirosina quinasas no receptoras (p. Ej., Miembros de la familia c-Src), por lo que median una segunda ola de señalización. 124,125 Además, al unirse a GPCR activados como el AT1aTambién se ha demostrado que la R, β-arrestina es capaz de secuestrar y estructurar quinasas de señalización, así como de dirigir complejos de señalización activos en microcompartimentos endosomales citoplasmáticos. 125,126 Es importante destacar que la inhibición química o molecular de la endocitosis del receptor (o, alternativamente, la expresión de mutantes de β-arrestina que perjudican la internalización del receptor), puede conducir a una disminución en dicha señalización descendente, lo que demuestra un acoplamiento entre endocitosis y señalización. 124,127

Además de la activación de c-Src, se ha demostrado en múltiples estudios que la β-arrestina funciona como un intermedio de señalización en la transducción de señales de GPCR a las rutas de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), en condiciones en las que el acoplamiento de la proteína G está prácticamente ausente. 125,128,129 Aunque esta señalización dependiente de β-arrestina se ha caracterizado mejor para la activación de ERK, también puede aplicarse a otras quinasas de señalización y parece desempeñar funciones en una variedad de respuestas celulares, incluidas la quimiotaxis y la antiapoptosis. Aunque todavía no se ha determinado de manera concluyente que la endocitosis del receptor sea necesaria para esta vía de β-arrestina, datos recientes sugieren que los patrones de tráfico de los complejos de β-arrestina / receptor pueden desempeñar un papel importante. 130,131 Curiosamente, la ubiquitinación de β-arrestina en sitios aceptores específicos (p. Ej., Ubiquitinación de lisinas 11 y 12 inducida por Ang II en β-arrestina2) es crucial para la β-arrestina / AT estable1Interacción R, así como la formación y localización endosomal de AT1Signalosomas R-MAPK. Actualmente se desconoce si esta observación puede ser ampliamente aplicable a otros GPCR relevantes para la biología cardiovascular y es un área de investigación activa.

Conclusiones

Dentro del sistema cardiovascular, la regulación del tráfico de GPCR es de fundamental importancia tanto para la homeostasis fisiológica como para la respuesta molecular a la perturbación fisiológica. Existe un movimiento eficiente y coordinado de los GPCR desde la síntesis hasta la superficie celular, donde pueden interactuar con componentes del medio extracelular para transducir señales a los efectores intracelulares y la posterior recuperación de GPCR de la superficie celular. Estos procesos resaltan el intrincado equilibrio celular que se ha desarrollado para regular de manera exquisita la capacidad de respuesta hormonal a nivel de los tejidos. De hecho, se ha aprendido mucho sobre el tráfico de GPCR dentro del sistema cardiovascular durante las últimas dos décadas, como lo demuestra el conjunto en constante expansión de proteínas identificadas cruciales para este proceso. El reconocimiento reciente de que la señalización de GPCR puede ocurrir dentro del sistema cardiovascular a través de vías independientes de la proteína G / dependientes de β-arrestina plantea la fascinante posibilidad de que se puedan desarrollar ligandos cardiovasculares farmacológicamente relevantes que permitan la señalización selectiva de GPCR a través de la activación de proteínas que inicialmente se creía solo tener un papel en la limitación de la señalización de GPCR y promover la eliminación de GPCR de la superficie celular.

Original recibido el 30 de junio de 2006 Revisión recibida el 10 de agosto de 2006 aceptado el 11 de agosto de 2006.

Agradecemos a Donna Addison y Elizabeth Hall por su excelente asistencia de secretaría.


Si una célula tiene dos GPCR diferentes, ¿cómo diferencia la célula entre la cascada de fosforilación causada por cada uno? - biología

C2006 / F2402 '11 ESQUEMA DE LA CONFERENCIA # 15

(c) 2011 Dra. Deborah Mowshowitz, Universidad de Columbia, Nueva York, NY. Última actualización 24/03/2011 02:16 PM.
Folletos: 14A - Descripción general de la señalización: la teoría biológica del Big Bang
14B - Estructura de las proteínas G y la vía cAMP de GPCR
15A - Revestimiento del circuito típico GI Tract & amp
15B - Homeostasis) - Vista de balancín para la regulación de la glucosa y la temperatura

I . Como hacer Intracelular ¿Funcionan los receptores? (cont.). Ver Sadava fig. 7,9 (15,8)

A-E. Ver última conferencia.

F. Ejemplo: estrógeno (un esteroide)

1. Mecanismo básico . E & # 8594 se une a receptores de estrógenos y el complejo # 8594 se une a elementos de respuesta de estrógenos (ERE) en regiones reguladoras de genes diana (múltiples). La unión & # 8594 aumentó la transcripción de algunos genes (genes activados) disminuyó la transcripción de otros (genes reprimidos).

2. Ejemplo de algunas proteínas controladas por E - controla la producción de receptores para otras hormonas. Por ejemplo, durante el embarazo controla la producción de receptores de oxitocina (en el útero) y prolactina (en la mama). La oxitocina controla las contracciones del nacimiento. La prolactina controla la producción de leche.

una. En el útero: unión de estrógeno & # 8594 activa transcripción de genes para receptores de oxitocina & # 8594 producción de nuevos receptores para oxitocina = regulación de receptores de oxitocina. Receptores necesarios para permitir la respuesta a la señal de contracción (oxitocina) & # 8594 contracciones & # 8594 al nacimiento.

B. En pecho: unión de estrógeno & # 8594 inhibe transcripción de genes para receptores de prolactina & # 8594 regulación a la baja de receptores de prolactina al nacer, el nivel de estrógeno cae y la inhibición se detiene & # 8594 transcripción del gen para receptores de prolactina & # 8594 síntesis de receptores de prolactina & # 8594 respuesta a la señal de lactancia (prolactina).

  • Todas las células (excepto el sistema inmunológico) tienen los mismos sitios reguladores que actúan en cis: los mismos HRE, potenciadores, etc.
  • Son los factores de acción trans, como los receptores de hormonas, los que varían, no los sitios reguladores que actúan en cis.
  • Todas las celdas tienen el mismo genes para los factores de acción trans, receptores, etc., pero se utilizan diferentes genes para producir proteínas reguladoras en diferentes células.

Más adelante se discutirán otros ejemplos de cómo las hormonas pueden dar diferentes resultados en diferentes tejidos. En general, lo que hace cualquier hormona depende de la combinación de proteínas (enzimas, TF, etc.) que ya se encuentran en la célula diana.

Pruebe el problema 6-19. A estas alturas deberías poder hacer 6-12 a 6-15.

II. Tipos de receptores de superficie celular (transmembrana) (ver la parte inferior de 14A)

A. Canales. Algunos receptores son ellos mismos (parte de) canales. Véase el receptor de AcCh en la conferencia anterior y la fig. De Sadava. 7.6 (15.5) Otros receptores no son canales, pero funcionan abriendo o cerrando canales separados. Los canales serán discutidos la próxima semana por el Dr. Firestein.

B. Tipos de receptores de superficie celular que no son canales

1. Tipo 1: ligado a proteínas G.

una. Terminología: Denominados receptores ligados a la proteína G, o GRAMO PAGrotein Csuperado Receptores (GPCR). Para un caso generalizado, ver Sadava fig. 7,8 (15,7).

B. Estructura: Todas son proteínas transmembrana de 7 pasos con la misma estructura básica, todas pertenecen a la misma familia de proteínas / genes. (Consulte Becker 14-4 o la parte superior del folleto 14B).

C. ¿Para qué son los receptores? Muchas hormonas como la TSH y la epinefrina utilizan GPCR.

D. ¿Cómo trabajan? Active una proteína G, que actúa como un interruptor para activar la amplificación (detalles a continuación). Las proteínas G generalmente:

(1). Activar enzimas que generan segundos mensajeros (ver Sadava fig. 7.8 (15.7)), o

(2). Canales iónicos abiertos / cerrados.

2. Tipo 2: No ligado a proteínas G. Se analizará con más detalle más adelante cuando lleguemos al ciclo celular y al cáncer. Para referencia:

una. Muchas son proteína quinasas. Además del dominio extracelular de unión al ligando, tiene un dominio quinasa intracelular o interactúa con una quinasa intracelular (cuando se activa).

B. Tipo más conocido: Receptores de tirosina quinasas (RTK): también llamados receptores unidos a TK.

C. Estructura: Por lo general, son proteínas de un solo paso que se agregan en dímeros cuando se activan.

D. ¿Para qué son los receptores? Muchos factores de crecimiento utilizan receptores ligados a TK o receptores relacionados. (Consulte la tabla 14-3 de Becker si tiene curiosidad).

mi. ¿Cómo trabajan? Estos suelen generar cascadas de modificaciones, pero no siempre utilizan segundos mensajeros. Si quiere ver un ejemplo, vea los higos de Sadava. 7,6 y 7,12 (15,6 y 15,10). No llegaremos a los detalles de cómo funcionan por un tiempo.


III. Proteínas G: ¿cómo encajan? ¿Cómo trabajan?

A. ¿Cuáles son las propiedades importantes de las proteínas G? (Consulte la figura 14-5 de Becker y el folleto 14B).

1. Tener formas activas e inactivas

una. La forma activa está vinculada a GTP

B. La forma inactiva está ligada al PIB.

2. Las proteínas G actúan como interruptores en muchos procesos (no solo como señalización)

una. Activación: La proteína G se activa descargando GDP y recogiendo GTP en respuesta a alguna señal.

B. Inactivación: La proteína G se inactiva a sí misma catalizando la hidrólisis de GTP a GDP.

C. ¿Por qué es un cambio? La proteína G no permanece activa por mucho tiempo. `` Se apaga solo ''.

B. Vía típica: función en la señalización (ver también el folleto 14B, panel central)

ligando (primer mensajero) se une fuera de la célula activar el receptor en la membrana activar la proteína G en la membrana activar la enzima diana en la membrana generar molécula pequeña (segundo mensajero) dentro de la célula

Tenga en cuenta que el ligando (primer mensajero) se une al dominio extracelular de su receptor. Los eventos restantes están dentro de la celda. Más sobre los segundos mensajeros a continuación.

C. Activación e inactivación de proteínas G

1 . Intercambio de GTP: mecanismo de activación & amp inactivación

una. Reacción de activación (Intercambio GTP / GDP, NO fosforilación del GDP GTP reemplaza al GDP):

Proteína-GDP (inactivo) + GTP & # 8594 Proteína-GTP (activa) + GDP

B. Reacción de inactivación (hidrólisis de GTP unido a GDP):

Proteína-GTP (activa) y # 8594 Proteína-GDP (inactiva) + fosfato.

C. En general: GTP desplaza a GDP, activando la proteína G GTP luego se hidroliza (generalmente rápidamente), devolviendo la proteína G a su estado inactivo.

(1). Efecto neto sobre la hidrólisis de GTP - GTP: GTP (+ agua) & # 8594 GDP + fosfato

(2). NetoEfecto sobre la proteína G - ninguno: La proteína se activa temporalmente, pero luego se inactiva. Sin embargo, los ciclos de proteínas de inactivos a activos y de regreso a inactivos actúan como un interruptor.

D. Terminología. Dado que el resultado general es que GTP se hidroliza a GDP, las proteínas G a veces se denominan `` GTPasas ''.

2. ¿Qué desencadena la activación?

una. Caso general: La unión de una proteína llamada GEF (factor de intercambio guanina-nucleótido) hace que el GDP se caiga y GTP se une.

B. En señalización: GPCR activado = GEF. La unión del receptor activado a la proteína G desencadena la activación de la proteína G (causa la pérdida de GDP).

3. ¿Qué desencadena la inactivación?

una. La proteína G en sí misma tiene actividad enzimática. - cataliza la inactivación (hidrólisis).

B. No se requiere disparador - la hidrólisis de GTP a GDP ocurre automáticamente.

C. Otras proteínas pueden aumentar la velocidad de hidrólisis. Se denominan proteínas RGS (Reguladores de la señalización de proteínas G) o proteínas GAP (Proteínas Activadoras de GTPasa).

D. Tipos de proteínas G

1. Subunidades - Las proteínas G ordinarias son triméricas = tienen 3 subunidades.

una. G prot inactivo = heterotrímero de alfa, beta, gamma

B. La separación ocurre en la activación: En la activación, la subunidad alfa (con el GTP) se separa de otras 2 subunidades.

C. Cualquiera de las partes puede ser el efector que realmente actúa sobre el objetivo - alfa, o beta + gamma, puede actuar como activador o inhibidor de la proteína diana.

D. La hidrólisis provoca la reasociación. La hidrólisis de GTP a GDP hace que el alfa se vuelva a asociar con otras subunidades y el heterotrímero inactivo # 8594

2. Proteínas G pequeñas: se analizarán más a fondo cuando lleguemos al ciclo celular y al cáncer. Para referencia:

una. Estructura: Las proteínas G pequeñas no tienen subunidades.

B. Ejemplo: la proteína llamada ras, importante en el control del crecimiento, muchas células cancerosas tienen ras hiperactiva.

C. Papel del intercambio GTP / PIB: Se activan mediante el intercambio de GTP / GDP y se inactivan mediante la hidrólisis de GTP a GDP, como se indicó anteriormente.

D. Los GPCR no los activan directamente (Están involucradas otras proteínas adaptadoras del 'intermediario')

3 . ¿Cuántas proteínas G?

una. Hay muchas proteínas G diferentes. Las proteínas G están involucradas en una gran cantidad de procesos celulares, no solo en la señalización. (Hemos ignorado su importancia hasta ahora. Consulte Becker para obtener detalles y muchos ejemplos).

B. Las proteínas G activas pueden ser inhibidoras o estimulantes.

C. Método de acción: Las proteínas G activadas actúan uniéndose y activando (o inhibiendo) otras enzimas / proteínas diana.

D. Terminología: Las diferentes proteínas G triméricas se conocen generalmente como Gpag, Gq GRAMOI, Gs etc. (Los libros difieren en los detalles de los nombres).

MI.Para referencia: Comparación de proteínas quinasas, proteínas quinasas receptoras y proteínas G amp triméricas

Proteína Cataliza ¿Qué se agrega a Target Protein? ¿Quién obtiene el P o el GTP? ¿Qué tan inactivo?
Proteína quinasa Proteína + ATP y # 8594 ADP + proteína-PAG Fosfato Por lo general, dif. proteína La fosfatasa separada elimina PAG
Receptor de proteína quinasa ** Proteína + ATP y # 8594 ADP + proteína-PAG Fosfato Por lo general, una subunidad separada del yo La fosfatasa separada elimina PAG
Trimérico
Proteína G
Intercambio e hidrólisis como se describe anteriormente. GTP Sí mismo Hidroliza GTP a GDP (por sí mismo)

** Las proteínas quinasas receptoras tienen un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio de quinasa intracelular (o de unión a quinasa). Las quinasas ordinarias suelen añadir fosfatos a otras proteínas. Las quinasas receptoras generalmente se agregan fosfatos a sí mismas. (Para un ejemplo, vea Sadava fig. 7.7 (15.6)

Pruebe los problemas 6-1 y 6-2.

III. Segundos Mensajeros - ¿Cómo encajan? ¿Cómo trabajan?

A. Camino típico: ¿dónde encaja el segundo mensajero? (ver también el folleto 14B, panel central)

ligando (primer mensajero) se une fuera de la célula activar el receptor en la membrana activar la proteína G en la membrana activar la enzima diana en la membrana generar molécula pequeña (segundo mensajero) dentro de la célula

B. ¿Qué son los segundos mensajeros? - Consulte el folleto 14B o la fig. De Sadava. 7,8 (15,7)

1. ¿Qué son? Pequeñas moléculas o iones que se mueven a través de la célula y se unen a sus proteínas objetivo.

2 . Los segundos mensajeros habituales - consulte el folleto 14B para conocer la estructura del AMPc y el modo de acción

Segundo mensajero ¿De dónde viene? ¿Cómo se hace?
acampar ATP por acción de la adenil ciclasa
DAG y amplificador IP3 lípido de membrana por acción de la fosfolipasa C
Ca 2+ Ca 2+ almacenado en ER (o extracelular) abriendo canales (en ER / memb. de plasma)

3. ¿Qué hacen los segundos mensajeros? Se unen y de ese modo activan (o inactivan) las proteínas diana.

4. Cómo se hacen : La proteína G activa (subunidad) & # 8594 se une a & amp activa la enzima en (o asociada con) la membrana & # 8594 genera un segundo mensajero en el citoplasma. Véase la fig. De Becker. 14-7 o higos Sadava. 7.8 y 7.14 (15.7 y 15.12) para la vía cAMP. Llegaremos a la vía IP3 más tarde. Si tiene curiosidad, consulte la fig. De Becker. 14-10 o Sadava fig. 7,15 (15,13).

5. Un ejemplo específico: Hormona estimulante de la tiroides (TSH): promueve la liberación de hormona tiroidea (TH).

una. Generación de segundo mensajero (cAMP)

TSH (primer mensajero) se une activar GPCR en la membrana activar la proteína G en la membrana activar la enzima en la membrana (adenil ciclasa) generar una molécula pequeña (segundo mensajero) dentro de la célula = cAMP

B. Acción del segundo mensajero

acampar activar la proteína quinasa (PKA) en el citoplasma fosforilar enzimas diana estimular múltiples pasos en la síntesis y liberación de TH

6. ¿Por qué molestarse con todos estos pasos?

una. Amplificación. Muchos pasos implican ampliaciones. Por ejemplo, una molécula de adenil ciclasa activa puede generar muchas moléculas de cAMP y una molécula de PKA puede fosforilar muchas moléculas de sus enzimas diana. Para ver un ejemplo de las posibilidades de una cascada de amplificación, consulte la fig. De Becker. 14-3 o Sadava fig. 7,20 (15,18). (No se ponen de acuerdo sobre los números exactos).

B. Ejemplos. El ejemplo habitual de este tipo de cascada de modificación es la degradación del glucógeno, estimulada por la hormona epinefrina (adrenalina), que es el ejemplo de la fig. De Becker. 14-3. Este ejemplo fue el primero en ser descubierto, pero es más complejo que el caso de TSH.

Si está interesado en los detalles o desea seguir leyendo, consulte la fig. De Sadava. 7,20 (15,18) o las figs. De Becker. 14-25 (14-24) & amp 6-17 (6-18), o el folleto en http://www.columbia.edu/cu/biology/courses/c2006/handouts/glycogen09.pdf.


IV. Un ejemplo de un segundo mensajero: AMPc y su objetivo (PKA) Consulte el folleto 14B
o Becker fig. 14-7.

A. ¿Cómo se regula el nivel de cAMP? ¿Qué hace?

1. ¿Cómo se fabrica el cAMP?

una. La proteína G activa la adenil ciclasa (también llamada adenilil ciclasa o AC)

B. AMPc hecho de ATP por adenil ciclasa para la estructura de cAMP, vea el folleto y la fig. de Becker. 14-6 o Sadava fig. 7,14 (15,12).

2. ¿Qué hace cAMP? Consulte la tabla de Becker 14-1 (14-5).

una. AMPc se une y activa la proteína quinasa A = PKA . (También llamado Ccíclico ADependiente de MP pagrotein kinase = cAPK) Véase la fig. de Becker. 14-8.

B. PKA agrega fosfatos a otras proteínas

(1). La fosforilación por PKA puede activar o inhibir la proteína diana (diana = sustrato de PKA)

(2). La acción de la PKA puede modificar otras quinasas / fosfatasas y comenzar una cascada.

(3). El resultado final varía. Depende de qué quinasas y fosfatasas en ese tejido son objetivos (sustratos) de PKA y / o las otras quinasas / fosfatasas (al final de la cascada). Vea el ejemplo a continuación.

3. ¿Cómo se apaga el sistema de señales cuando sale la hormona?

una. La proteína G no permanece activada por mucho tiempo: La proteína G activada hidroliza su propio GTP & # 8594 GDP (& # 8594 proteína G inactiva).

B. cAMP es de corta duración - es hidrolizado por fosfodiesterasa (PDE)

C. En ausencia de cAMP, la acción de las quinasas se detiene y / o se invierte.

(1) PKA se inactiva

(2) Las fosfatasas se activan: eliminan los fosfatos añadidos por las quinasas

B. ¿Cómo funcionan las hormonas a través del cAMP?

1. TSH - ver arriba. La PKA fosforila (y activa) las enzimas necesarias para producir la hormona tiroidea.

2 . Metabolismo del glucógeno: Este caso es muy complejo y se discutirá más adelante. Consulte más arriba para obtener referencias.


V. Introducción a la fisiología y los organismos multicelulares: ¿para qué sirve la señalización?

A. Estilo de vida unicelular frente a multicelular

1. Organismos unicelulares

una. Rodeado externo medio ambiente -- Hipocresía cambiarlo o regularlo

B. Tengo uno Función básica - crecer y multiplicarse

C. Responder a condiciones externas (ya que no se pueden cambiar) para mantener un estado intracelular óptimo

(1). Recoger y / o tirar lo necesario para el metabolismo.

(2). Mantenga las condiciones intracelulares (pH, nivel de aminoácidos, oxígeno, etc.) lo más constante posible y gaste una energía mínima ajustando las tasas de transcripción, actividad enzimática, etc.

D. Nota sin especialización: cada celda hace todas las funciones posibles

2. Organismos multicelulares y homeostasis

  • plasma = parte líquida de la sangre = líquido entre las células sanguíneas

  • líquido intersticial (IF) = líquido entre todas las demás células

C. Cada celda tiene dos funciones básicas

(1). Crecer o mantenerse como arriba

(2). Papel especializado en el mantenimiento de la homeostasis de todo el organismo.

D. Las celdas son Especializado. El mantenimiento de la homeostasis requiere la cooperación de muchos tipos de células diferentes, no solo circuitos dentro de una sola célula.

Organismos unicelulares Organismos multicelulares
¿Qué rodea a la celda? Ambiente externo Entorno interno del organismo
¿Puede el organismo regular lo que rodea a cada célula? No
¿Cuántas funciones tiene cada celda? 1 2 o más
¿Está la célula especializada? No

B. Organización - ¿Cómo se configuran las células para cooperar en un organismo multicelular? Ver 15A.

1. Células, tejidos y los 4 tipos principales de tejidos (5, si cuenta la sangre por separado) - vea la lección # 4, & amp Sadava fig. 40,7

2. Órganos

una. Hecho de (diferentes tipos de) tejidos.

B. Ejemplo: revestimiento del tracto gastrointestinal. Tiene capas de diferentes tejidos: epitelial, conectivo, muscular y nervioso, estos sirven principalmente para la absorción (de material de la luz), soporte, contracción y regulación, respectivamente. (Vea el folleto 15A o Sadava fig. 40.7) La sangre (un tipo de conectivo) no encaja realmente en esta clasificación; sirve para el transporte de materiales hacia adentro y hacia afuera.

3. Sistemas - Grupo de órganos y # 8594 cuerpo o sistema de órganos. Trabajen juntos para mantener la homeostasis de algún componente. Ver Sadava 40.1 (8ª ed). El número de sistemas depende de quién está contando. El número habitual es 8-12.

una. Sistema inmune - responde principalmente a cambios internos provocados por la presencia de organismos extraños (o sus macromoléculas) - responde a virus, bacterias, células cancerosas, etc. (rechazo de injertos, alergia, etc. son efectos secundarios de esto).

B. Otros sistemas - responder a cambios en el mileu interno provocados por otros factores.


VI. ¿Cómo se regula un componente del medio interno?

A. Principio general: la homeostasis se mantiene mediante la retroalimentación negativa

  • En fisiología, la retroalimentación negativa y positiva se definen como anteriormente. Para fb negativo, no importa si las correcciones se logran por inhibición (apagar el calentador para detener la producción de glucosa) o aceleración (encender el aire acondicionado, aumentar la absorción de glucosa de la sangre).

  • En bioquímica, la retroalimentación negativa generalmente significa inhibición de un paso anterior (& amp positivo fb generalmente significa activación).

  • 'Efector' también se usa de manera diferente en fisio y bioquímica, ver más abajo.

B. Ejemplo # 1 - Regulación de los niveles de glucosa en sangre. La vista de balancín. Consulte el folleto 15B o la fig. De Sadava. 51,18 (50,19). La fig. en la novena ed. no es un balancín, pero el punto es el mismo.

1. Tener una variable regulada - nivel de glucosa en sangre.

2. Necesita un sensor (o receptor) - para medir niveles de "variable regulada" (glucosa). Aquí, el sensor está en el páncreas.

3. Necesita efector (es) - para controlar los niveles de la variable regulada (glucosa) - suelen tener uno o más efectores que responden de forma opuesta. En este caso, los efectores de la captación de glucosa son el hígado, el tejido adiposo y el efector del músculo esquelético para la liberación de glucosa es el hígado.

Nota sobre la terminología: en fisiología, & quotefector & quot normalmente significa & quota tejido u órgano (como músculo o hígado) que lleva a cabo una acción y, por lo tanto, produce un efecto ''. En este ejemplo, los efectores = órganos que actúan para aumentar o disminuir la glucosa en sangre. En biología molecular, el término & quot; factor de cotización & quot se usa generalmente para significar & modulador de cuota de la función de la proteína & quot. Un modulador = una molécula pequeña (como un inductor, activador enzimático, etc.) que se une a una proteína, altera la forma y / o función de la proteína, y por lo tanto desencadenantes Un efecto.

4. Tener un punto de ajuste - el nivel que debe tener la variable regulada (glucosa en sangre). El punto de ajuste también se usa a veces para referirse al nivel en el que se activan las correcciones (para aumentar o disminuir el valor).

En la mayoría de los casos, no existe una diferencia significativa entre estas dos definiciones de punto de ajuste. En algunos casos, el valor deseado (primera definición) y el valor en el que se producen las correcciones (segunda definición) pueden ser diferentes. Por ejemplo, puede haber dos puntos de corte, superior e inferior, que delimitan el nivel deseado de una variable regulada. En niveles por encima o por debajo de los respectivos puntos de corte, se envían mensajes a los efectores apropiados para que tomen medidas correctivas. El término "valores críticos" se utiliza a veces en lugar de "puntos de ajuste" para describir los puntos de corte.

5. Señalización - Necesita algún sistema de señal para conectar los sensores y los efectores. Puede ser nervioso y / u hormonal. En este caso, la señal primaria (pero no la única) es hormonal y las hormonas primarias (señales) son insulina y glucagón.

6. Funcionamiento de la retroalimentación negativa - el sistema responde a negar desviaciones del punto de ajuste. Características importantes:

una. Funciona para estabilizar los niveles de glucosa en sangre. (la variable regulada)

B. El sistema se autocorrige - Se corrigen las desviaciones en cualquier dirección (si la glucosa en sangre es demasiado alta o demasiado baja).

C. Hay dos acciones opuestas de los efectores, no solo una.

(1). Si [G] aumenta demasiado, los efectores absorben G de la sangre. (mitad superior del diagrama de balancín)

(2). Si la sangre [G] baja demasiado, el efector libera G a la sangre. (mitad inferior del diagrama de balancín)

D. La retroalimentación negativa no siempre es inhibición. La desviación del punto de ajuste puede arreglarse acelerando, no inhibiendo, un proceso. En la retroalimentación negativa, las desviaciones del punto de ajuste se pueden corregir acelerando un proceso (como la absorción de glucosa) o ralentizando un proceso (como la descomposición del glucógeno en glucosa). Por ejemplo:

(1). Si la sangre [G] sube, la captación de sangre aumenta y la degradación del glucógeno disminuye. En este caso, un aumento en la captación de glucosa se utiliza para ayudar disminución la desviación del punto de ajuste.

(2). Si la sangre [G] desciende, la liberación a la sangre aumenta y la síntesis de glucógeno disminuye. En este caso, un aumento en la liberación de glucosa se utiliza para ayudar disminución la desviación del punto de ajuste.

(3). En ambos casos, se aumenta un proceso y se inhibe otro para ayudar a disminuir la desviación del punto de ajuste.

7. Resultado neto - La variable regulada ([G] en sangre) no es constante, pero permanece cerca del punto de ajuste.

Consulte el problema 5-1 y amp 5-2 a y amp b.

C.Ejemplo n. ° 2: Regulación de la temperatura corporal (en humanos): la vista del balancín (folleto 15B)

1. Tenga en cuenta que muchas características son las mismas que en el caso de la glucosa. (¿Puedes enumerarlos?)

2. Características que no se encuentran en la caja de glucosa:

una. Múltiples sensores en diferentes lugares. (para temperatura central y cutánea). ¿Cómo integrar múltiples entradas?

B. Naturaleza de la señal - Las señales son neuronales, no hormonales.

C. Centro integrador (IC)

(1). Papel de IC: compara el punto de ajuste con el valor real, envía el mensaje apropiado a los efectores.

(2). Tipo de CI

(a). La función de sensor / IC puede combinarse, como en el ejemplo de glucosa.

(B). Se necesita un IC separado si hay varios sensores, como en este caso. IC coordina la información entrante de múltiples sensores

(3). En este ejemplo, IC = hipotálamo (HT)