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¿Reloj universal para humanos contenido en las secuencias teloméricas?

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No sé si esto tendría sentido, pero imagina que solo podríamos sufrir el envejecimiento natural (no las enfermedades involucradas). ¿Existe una estimación de cuál es nuestra vida útil máxima natural que puede tener un ser humano?

Aprendí que las secuencias teloméricas protegen la información sensible en el ADN y que las células somáticas sufren un corte de estas secuencias en cada replicación. Entonces me pregunto si este es un reloj natural, y si se ha estimado cuánto tiempo tenemos naturalmente.


Telómeros y estrés en la vida temprana

Stefanie Mayer,. Kathryn K. Ridout, en Estrés: genética, epigenética y genómica, 2021

Factores que afectan la longitud de los telómeros

La longitud de los telómeros se ve afectada por interacciones complejas entre exposiciones ambientales y procesos celulares, incluido el daño oxidativo, el estrés por replicación del ADN, los cambios epigenéticos y los polimorfismos genéticos. Los nucleótidos de guanina (G), que constituyen el 50% de la secuencia de los telómeros, tienen un bajo potencial de reducción y, por tanto, son particularmente sensibles al daño oxidativo. 15 En estados de estrés oxidativo cuando las especies reactivas de oxígeno superan en número a los mecanismos antioxidantes, la oxidación puede inducir el acortamiento de los telómeros, la senescencia celular y la muerte celular. 16 La exposición a radiaciones ionizantes o carcinógenos puede provocar daños en el ADN de los telómeros. 17 Este daño desencadena procesos de reparación por escisión de ADN 17 para ayudar a restaurar la integridad de los telómeros a costa de acortar los telómeros.

La investigación emergente sugiere que las modificaciones epigenéticas pueden afectar la longitud de los telómeros. Las modificaciones epigenéticas permiten la elaboración del genoma más allá de lo que determina el ADN. Estas modificaciones se llevan adelante durante la división celular, pero no cambian la secuencia del ADN. La metilación es una de las formas más comunes de modificación epigenética 18 y puede alterar el estado de la cromatina de los telómeros. La metilación baja de los telómeros puede conducir a una señalización inapropiada de las vías de reparación del ADN y errores de secuencia y acortamiento del ADN de los telómeros. 19

Los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) han identificado loci genéticos que pueden contribuir a la variación de la longitud de los telómeros. En un estudio de sujetos con antecedentes de longevidad familiar, Lee et al. 20 encontraron tres loci (4q25, 17q23.2 y 10q11.21) asociados con la longitud de los telómeros. Mangino y col. 21 identificaron un locus en el cromosoma 18q12.2 asociado con la longitud de los telómeros, y en su metaanálisis, Mangino et al. 22 identificaron nuevas regiones genómicas asociadas con la variación de la longitud de los telómeros (17p13.1 y 19p12) y confirmaron asociaciones entre la longitud de los telómeros de los leucocitos y los loci 3q26.2 y 10q24.33. 21, 23, 24

Los polimorfismos genéticos parecen tener un papel importante en la regulación de la longitud de los telómeros en relación con el riesgo psicopatológico. Por ejemplo, los síndromes de telómeros debidos a mutaciones genéticas heredadas de la maquinaria de mantenimiento de los telómeros se asocian con secuelas neuropsiquiátricas características. 12 La longitud y longevidad de los telómeros también se han asociado con polimorfismos de nucleótido único (SNP) específicos en genes que producen telomerasa. 25, 26 SNP rs2736100, ubicado en el gen que codifica la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), está asociado con telómeros más cortos. Un estudio reciente de 2026 personas encontró que los homocigotos rs2736100 tenían tasas más altas de depresión que los portadores heterocigotos u homocigotos para el alelo protector. 27 Esta asociación solo ocurrió en sujetos sin antecedentes de ELS, lo que sugiere que los efectos de ELS sobre la longitud de los telómeros pueden ser lo suficientemente grandes como para ocultar las influencias genéticas.


5.4: Cladística

Por tanto, cuantas más diferencias haya en las secuencias biológicas, más tiempo ha pasado para que se acumulen las diferencias. Cuanto más tiempo ha pasado desde que los organismos han compartido un ancestro común, menos relacionados evolutivamente están los organismos entre sí.

Los rasgos homólogos se pueden usar para agrupar organismos en clados. Los rasgos compartidos entre las especies o grupos en un conjunto de datos tienden a formar patrones anidados que brindan información sobre cuándo ocurrieron los eventos de ramificación en el linaje.

Las mariposas, polillas y moscas están todas igualmente relacionadas con los escarabajos.

Las avispas están más relacionadas con las mariposas, polillas y moscas que con los escarabajos.

En 1735, Linnaeus publicó Systema Naturae en el que propuso un sistema de categorizar y nombrar organismos usando un formato estándar para que los científicos pudieran discutir organismos usando una terminología consistente. El árbol de la vida de Linneo contenía solo dos ramas principales para todos los seres vivos: los reinos animal y vegetal.

En 1866, Haeckel, propuso otro reino, Protista, para organismos unicelulares. Más tarde propuso un cuarto reino, Monera, para organismos unicelulares cuyas células carecen de núcleo, como las bacterias.

En 1969, Whittaker propuso agregar otro reino, los hongos, en el árbol de la vida. El árbol de los cinco reinos de Whittaker se consideró el estándar durante muchos años.

En la década de 1970, Woese creó un árbol con tres Dominios por encima del nivel del Reino: Archaea, Bacteria y Eukarya.


& ltp> Esta sección proporciona información útil sobre la proteína, principalmente conocimientos biológicos. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> Función i

Se une a la repetición telomérica de doble cadena 5'-TTAGGG-3 'y desempeña un papel central en el mantenimiento de los telómeros y la protección contra la fusión de un extremo a otro de los cromosomas. Además de su función de unión al ADN telomérico, se requiere para reclutar una serie de factores y enzimas necesarios para la protección de los telómeros, incluido el complejo Shelterin, TERF2IP / RAP1 y DCLRE1B / Apollo. Componente del complejo Shelterin (telosoma) que participa en la regulación de la longitud y protección de los telómeros. Shelterin se asocia con matrices de repeticiones de 5'-TTAGGG-3 'de doble cadena añadidas por la telomerasa y protege los extremos de los cromosomas sin su actividad protectora, los telómeros ya no están ocultos de la vigilancia del daño del ADN y los extremos de los cromosomas se procesan de manera inapropiada por las vías de reparación del ADN. Junto con DCLRE1B / Apollo, juega un papel clave en la formación del bucle telomérico (bucle T) al generar un saliente monocatenario 3 'en los telómeros de los extremos principales: se han propuesto bucles T para proteger los extremos de los cromosomas de la degradación y reparación. Requerido tanto para reclutar DCLRE1B / Apollo a los telómeros como para activar la actividad exonucleasa de DCLRE1B / Apollo. Se une preferentemente a ADN superenrollado positivo. Junto con DCLRE1B / Apollo, necesario para controlar la cantidad de ADN topoisomerasa (TOP1, TOP2A y TOP2B) necesaria para la replicación de los telómeros durante el paso de la bifurcación y prevenir la topología aberrante de los telómeros. Recluta TERF2IP / RAP1 para los telómeros, participando así en la represión de la reparación dirigida por homología (HDR), que puede afectar la longitud de los telómeros.

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Figura 2

Figura 2. TPP1 y diferentes estados teloméricos. a) TPP1 media las interacciones entre POT1, TIN2 y telomerasa (4). OB = pliegue de unión de oligonucleótido / oligosacárido RD = dominio de reclutamiento, también llamado PBD (4) S / T = región rica en serina / treonina TID = dominio de interacción TIN2. La nomenclatura es de la ref. 5. b) Estados teloméricos. (i) Estado no extensible. POT1 se une al extremo 3 'telomérico, evitando el alargamiento por la telomerasa. El telómero se muestra aquí en forma lineal. El t-loop también debería corresponder a un estado no extensible (ver texto). (ii) Estado extensible. Los mecanismos desconocidos pueden disociar o desplazar la POT1 unida al extremo telomérico, o evitar que se una, para permitir el acceso de la telomerasa. La telomerasa puede enriquecerse en los telómeros. vía TPP1, que se une indirectamente al tracto telomérico bicatenario. (iii) Estado extendido. Durante la extensión, la actividad y procesividad de la telomerasa son estimuladas por TPP1 unido a más moléculas de POT1 internas.

Se sabe desde hace algún tiempo que el complejo de refugio de seis componentes está involucrado en el control de la longitud de los telómeros (1, 2). Por ejemplo, la inhibición de TRF1 conduce a la elongación de los telómeros, mientras que la sobreexpresión de TRF1 provoca un acortamiento de los telómeros en las células positivas a la telomerasa humana sin afectar la actividad de la telomerasa. La reducción de los niveles de proteína TIN2 o la sobreexpresión de alelos mutantes que interrumpen la interacción TIN2 con TPP1 conduce al alargamiento de los telómeros (13, 14). La supresión de TPP1 por interferencia de ARN o la interrupción de la interacción TPP1-POT1, que se acompaña de la pérdida de la señal POT1 en los telómeros, también da como resultado el alargamiento de los telómeros (7, 8). Por tanto, el refuerzo del complejo Shelterin parece inhibir la telomerasa. Los telómeros más largos cargan más complejos de refugio, y esto puede proporcionar un mecanismo de detección de longitud (1). Además, la proteina, en particular la TRF2, promueve la formación de t-bucles en los que el saliente telomérico 3 'está metido en la parte bicatenaria del telómero (15). Esto puede secuestrar el saliente 3 'de los factores de reparación del ADN, así como de la telomerasa. Además, la Shelterina puede promover la unión de POT1 al extremo 3 'telomérico, que también inhibe la telomerasa (16). En efecto, in vitro Los estudios demuestran que POT1, cuando se une al extremo 3 'telomérico, prohíbe la unión y extensión por la telomerasa (Figura 22, panel b, estado i) (12, 17). Por lo tanto, el complejo de Shelterin hasta ahora se ha relacionado principalmente con la inhibición de la telomerasa. Sin embargo, los telómeros deben cambiar de estados no extensibles a extensibles, al menos en células positivas para telomerasa (3, 18).

Ahora, ambos nuevos artículos refuerzan la opinión de que los componentes de la Shelin también tienen una función de activación de la telomerasa. Una interacción física entre TPP1 y telomerasa humana se demuestra por la coinmunoprecipitación de TPP1 y telomerasa expresada en lisado de reticulocitos de conejo y en extractos celulares (5). El pliegue OB de TPP1 es necesario y suficiente para esta interacción, una indicación de que TPP1 recluta telomerasa a los telómeros a través de su pliegue OB (5). Debido a que TPP1 no se une directamente al ADN telomérico, podría ejercer esta función cuando se une al tracto telomérico bicatenario. vía TIN2 / TRF1 / TRF2 o al voladizo 3 ′ vía POT1 (5) (Figura 22, panel b, estado ii). Wang et al.(4) realizado detallado in vitro Ensayos de actividad de telomerasa en presencia de POT1 y TPP1 y funciones activadoras descubiertas, además de una posible función de reclutamiento. Se sabe que POT1 inhibe la actividad de la telomerasa cuando se une al extremo 3 'telomérico, y esta inhibición no se supera con la asociación con TPP1. Por lo tanto, Wang et al. unión forzada de POT1 con una mutación puntual del ADN del cebador a un registro más aguas arriba, dejando una cola 3 'extensible con telomerasa (Figura 22, panel b, estado iii). De hecho, en esta condición experimental, POT1 y TPP1 no solo mejoraron la actividad total de la telomerasa, sino que también aumentaron la procesividad de la telomerasa, un efecto que requiere la interacción TPP1-POT1. Además, las dos proteínas juntas pudieron rescatar la procesividad de la telomerasa en un oligonucleótido formador de G-quadruplex, probablemente debido a la capacidad de POT1 para atrapar una forma abierta de esta estructura (19).

En resumen, los dos artículos identifican a TPP1 como un regulador íntimo y directo de la telomerasa humana. TPP1 media la comunicación entre la Shelin y la telomerasa. También puede proporcionar un objetivo ideal para regular la actividad de la telomerasa en los extremos de los cromosomas individuales para desencadenar el reclutamiento preferencial y / o la activación en los telómeros cortos. Los nuevos datos proporcionan una instantánea molecular del efecto estimulante del complejo de proteínas de unión a telómeros POT1-TPP1 durante la extensión mediada por telomerasa. Sin embargo, la naturaleza molecular de este y otros estados teloméricos y el mecanismo de su transición quedan por dilucidar y deben estudiarse con más detalle. Un modelo posible es que la vivienda suministra POT1 a los extremos teloméricos 3 'para evitar su elongación por la telomerasa, lo que da como resultado un estado no extensible (Figura 22, panel b, estado i) (12, 16, 17). Los mecanismos desconocidos pueden disociar o desplazar el POT1 unido al extremo telomérico o evitar que se una, permitiendo así el acceso de la telomerasa y produciendo un estado extensible (Figura 22, panel b, estado ii). Esto permitiría la formación de un estado de extensión en el que la telomerasa es estimulada por TPP1 unido a más moléculas de POT1 internas (Figura 22, panel b, estado iii). Esta dualidad de POT1 es una reminiscencia de los estudios en levadura en gemación, donde el saliente monocatenario está unido por Cdc13p (ciclo de división celular 13), otra proteína que contiene pliegues OB que tiene una similitud estructural débil con POT1. La proteína Cdc13p recluta la holoenzima de la telomerasa en la fase S vía una subunidad de la telomerasa llamada Est1p (telómero 1 cada vez más corto) (20). Esta interacción es fundamental para el mantenimiento de los telómeros, porque est1 las cepas de levadura experimentan senescencia celular. Sin embargo, Cdc13p también puede regular negativamente el alargamiento de los telómeros (21). No obstante, la levadura en ciernes Est1p no es homóloga a TPP1 y, por lo tanto, puede que no cumpla una función análoga. En Saccharomycescerevisiae, las proteínas cinasas similares a fosfatidil inositol-3 Tel1 y el punto de control de entrada de mitosis 1 (Mec1) (ATM (ataxia telangiectasia mutada) y ATR (ATM y Rad3 relacionado en humanos)) también parecen jugar un papel crítico en la activación preferencial de la telomerasa en telómeros cortos. Curiosamente, estas quinasas también se asocian con los telómeros humanos de una manera dependiente del ciclo celular (22), y será fascinante descubrir si mecanismos similares regulan la función de TPP1 y la actividad de la telomerasa en los telómeros humanos.


Cuantificar la longitud de los telómeros

Las técnicas más comúnmente utilizadas para medir la longitud de los telómeros son la transferencia de Southern, las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación in situ. Southern blot o análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el método tradicional y todavía se considera el estándar de oro [22]. Los telómeros se representan como frotis y el peso del frotis es representativo de la longitud media de los telómeros. La principal desventaja de esta técnica son las cantidades relativamente altas de ADN que se requieren. Por lo tanto, esta técnica no es factible para determinar la longitud de los telómeros en células individuales o para diferentes cromosomas, o cuando la disponibilidad de ADN es limitada. El método basado en PCR en tiempo real es relativamente rápido y solo requiere pequeñas cantidades de ADN genómico. Esta técnica se basa en cebadores de PCR modificados para evitar en la medida de lo posible la amplificación de cebadores-dímeros [13]. La medida final será una proporción de cantidad de telómeros dividida por una cantidad de gen de referencia (proporción T / S) que es una medida relativa, perfectamente válida dentro de una población dada (ya que clasificará correctamente a los sujetos) pero más difícil de comparar entre poblaciones. La ventaja más reciente es el desarrollo de un ensayo multiplex en el que tanto el telómero como el gen de referencia se dirigen a un solo pozo [14]. La técnica de PCR tiene la misma desventaja que el método TRF cuando se considera el análisis de una sola célula o de un cromosoma específico. La técnica de PCR cuantitativa ha sido ampliamente utilizada y aceptada para estimar la longitud de los telómeros en grandes estudios de cohortes [10, 15, 86, 93]. Una modificación específica de las técnicas anteriores es el análisis de longitud de un solo telómero, que utiliza técnicas de transferencia Southern para separar los productos amplificados por PCR, mediante la combinación de cebadores y sondas específicos para los telómeros y las regiones subteloméricas para medir la longitud de los telómeros por cromosoma [5]. En este momento, se cree que esta técnica es la medición de telómeros más precisa, pero es una técnica laboriosa y técnicamente desafiante que solo se puede usar para los cromosomas de los que se conoce la región subtelomérica. Las técnicas de hibridación in situ permiten visualizar los telómeros en células individuales. La hibridación cuantitativa de fluorescencia in situ (Q-FISH) utiliza un (CCCTAA)3 sonda de ácido nucleico peptídico para visualizar los telómeros. En las extensiones en metafase, los telómeros son visibles al final de los cromosomas y también pueden cuantificarse en cromosomas individuales [52]. Una variación importante de esta técnica es la hibridación in situ de fluorescencia de flujo, o Flow-FISH. Combinando la hibridación Q-FISH y el análisis de citometría de flujo, es posible medir la longitud media de los telómeros en células en interfase en combinación con anticuerpos de citometría de flujo estándar para seleccionar la población celular de interés [71].


Información de soporte

S1 Fig. Alineación de péptidos de homólogos de Nxf2.

Usamos NCBI web BLAST para buscar D. melanogaster Secuencia del péptido Nxf2 contra la base de datos de péptidos RefSeq y homólogos identificados en 22 Drosophila especies. La región carboxilo-terminal de Nxf2 se deriva de CDS que comparte homología con la TART-A TE (caja gris). A nivel de péptido, esta región se conserva para D. virilis, lo que sugiere que, si se adquirió a partir de una inserción del TART-A TE, la inserción se habría producido en el antepasado común de todo el género. CDS, secuencia codificante TE, elemento transponible.

S2 Fig. Vista ampliada de la gráfica de puntos que muestra las alineaciones de D. melanogaster TART-A versus D. melanogaster nxf2 y D. yakuba TART-A.

Los recuadros rosas muestran los 2 segmentos de homología compartida entre D. melanogaster TART-A y D. melanogaster nxf2. D. yakuba TART-A se alinea con D. melanogaster TART-A en regiones directamente adyacentes, pero sin incluir, el TART-A / nxf2 homología compartida. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data.

S3 Fig. Comparaciones intraespecíficas de nxf2 versus TART-A.

Comparamos nxf2 secuencias de transcripción de D. melanogaster (A), D. yakuba (B) y D. sechellia (C) a TART-A secuencias de la misma especie usando máscara [106]. Hay homología de secuencia presente entre D. melanogaster nxf2 y TART-A pero no para D. yakuba nxf2 / TART-A ni para D. sechellia nxf2 / TART-A. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data.

S4 Fig. Alineación de nxf2-como región de 71 D. melanogaster TART-A elementos.

Identificamos 71 TART-A elementos con 3 ′ UTR de 17 lecturas largas D. melanogaster ensamblajes del genoma. Los 71 elementos contienen el nxf2-como secuencia (cuadro gris) que sugiere que esta región está presente en la mayoría, si no en todos, TART-A elementos en D. melanogaster. Tenga en cuenta que una parte del nxf2-como región parece haber sido eliminada en uno de los TART-A elementos.

S5 Fig. Cobertura de secuenciación de Illumina del nxf2-como región de TART-A a través de la DGRP.

Comparamos la cobertura de secuenciación genómica para el nxf2-como región de TART-A (sombreado azul) a sus regiones flanqueantes aguas arriba y aguas abajo (sombreado amarillo). Para cada cepa de DGRP, dividimos la cobertura de lectura por la cobertura mediana de los TART-A ORF1 y ORF2 para controlar las diferencias en el número de copias entre cepas. Calculamos la cobertura para cada cepa en ventanas de 10 pb en toda la región. Cada cuadro de la figura resume los valores de cobertura por deformación para un solo segmento de 10 pb. Dentro de cada cuadro, la línea interna representa la cobertura mediana y las bisagras corresponden a los percentiles 25 y 75. Los bigotes se extienden hasta 1,5 veces el rango intercuartílico. La cobertura de la nxf2-like región es similar a la cobertura de la región de aguas abajo, las cuales se reducen en relación con la región de aguas arriba. Este patrón es consistente con el truncamiento de la UTR, que se ha descrito previamente para TARTA [74]. Porque el nxf2-como secuencia está presente en ambos UTR, el truncamiento del 5 ′ UTR, que es bastante común, debería reducir la cobertura de ambos nxf2-como la región y la región de flanqueo aguas abajo en aproximadamente un 50% en comparación con la región aguas arriba, que no está presente en la UTR 5 '(Fig 1B). Observamos una reducción en la cobertura de aproximadamente 30%, consistente con una mezcla de TART-A copias, algunas con UTR 5 ′ truncadas y otras sin. La cobertura mediana en todos los cuadros dentro de una región se muestra mediante las barras horizontales de colores. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. ORF, marco de lectura abierto.

S6 Fig. Regulación ascendente del elemento repetitivo en nxf2 derribar.

Cada repetición de RepBase para la que observamos expresión en los datos de la secuencia de ARN total de los ovarios femeninos se muestra en el eje y, y el cambio de veces en la expresión en el nxf2 Derribo de ARNi versus derribo de control del blanco El gen se muestra en el eje x con una escala log2. Los valores de expresión son la media de 2 réplicas biológicas tanto para la eliminación como para el control. Para los retrotransposones LTR, los LTR se muestran por separado del resto del TE. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. LTR, repetición terminal larga TE, elemento transponible.

S7 Fig. Correlación entre shRNAs en nxf2 derribar.

Usamos 2 shRNA que se dirigen a diferentes regiones del nxf2 transcripción y valores de expresión calculados para genes, así como TE para cada caída. Encontramos que los valores de expresión están altamente correlacionados entre los 2 experimentos (rho de Spearman = 0.92 [Genes] y 0.94 [TEs]). Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. ARNhc, ARN de horquilla corta TE, elemento transponible.

S8 Fig. nxf2 productos de escisión a partir de datos degradome-seq.

Analizamos los datos publicados de ARN pequeño inmunoprecipitado degradome-seq y Aub-inmunoprecipitado para determinar si había nxf2 lecturas degradome-seq que muestran el sentido de 10 pb: superposición antisentido con TART-A piRNA, consistente con la escisión por una proteína Piwi. Identificamos 11 ubicaciones (A – K) dentro del TARTA-como región de nxf2 donde los productos de escisión degradome-seq (rojo) se superponen con los piRNA antisentido (azul) en 10 pb en sus extremos 5 '. los nxf2 la transcripción se muestra en negro. degradome-seq, piRNA de secuenciación del degradome, ARN pequeño que interactúa con Piwi.

S9 Fig. Los genes regulados positivamente tras la interrupción de la ruta piRNA muestran una mayor abundancia de piRNA alineados.

Identificamos 168 genes cuyo cambio de expresión era mayor o igual a nxf2 a través de derribos de ARNi de 16 componentes de la vía de ARNpi. Estos genes tienen una abundancia significativamente mayor de piRNA alineados en comparación con el resto de genes expresados, lo que sugiere que su expresión puede estar regulada por piRNA (prueba de Wilcoxon PAG = 4.1e-06). Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. piRNA, ARN pequeño que interactúa con Piwi ARNi, interferencia de ARN.

S10 Fig. Los genes de la ruta del piRNA no muestran una respuesta uniforme a la alteración de la ruta del piRNA.

Examinamos el doble de cambio en la expresión de 41 genes conocidos de la vía piRNA a través de las caídas de RNAi de 16 componentes de la vía piRNA, excluyendo el gen objetivo del análisis para cada experimento. Los genes de la ruta del PiRNA muestran un cambio de pliegue mediano cercano a 1 (línea roja horizontal) para la mayoría de los experimentos. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. piRNA, ARN pequeño que interactúa con Piwi ARNi, interferencia de ARN.

S11 Fig. La correlación entre nxf2 expresión y TART-A el número de copia es reproducible.

Repetimos el análisis que se muestra en la Fig. 7A utilizando un conjunto de datos de microarrays replicado de [125] y encontramos una correlación similar (rho de Spearman = -0,49), lo que sugiere que las medidas de expresión de microarrays son altamente reproducibles. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data.

S12 Fig. Expresión de otros genes de la ruta piRNA (además de nxf2) no se correlaciona con TART-A número de copia.

Pudimos obtener valores de expresión para otros 39 genes de la ruta piRNA del mismo conjunto de datos de microarrays que usamos para nxf2 expresión. Para cada uno de estos genes, calculamos el coeficiente de correlación de Spearman para su expresión en comparación con TART-A número de copia. Todos los coeficientes de correlación son al menos 2 veces más pequeños en magnitud que lo que observamos para nxf2. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. piRNA, ARN pequeño que interactúa con Piwi.

S13 Fig. Resumen de las correlaciones entre los genes de la vía piRNA y TART-A número de copia.

El histograma resume los coeficientes de correlación de Spearman entre 39 genes de la vía piRNA y TART-A número de copia (mostrado en la Fig. S12). La línea roja muestra el coeficiente de correlación para nxf2. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. piRNA, ARN pequeño que interactúa con Piwi.

S14 Fig. Cobertura de piRNA por cepa de nxf2.

Trazamos la profundidad de lectura de piRNA (normalizada como RPM mapeada) a lo largo del nxf2 transcripción para cada una de las 16 cepas de DGRP que se muestran en la Fig. 7. Para cada cepa, la abundancia de TARTA piRNAs se enumeran en el título de la trama. Enmascaramos las ubicaciones de los TARTA/nxf2 homología compartida (cajas grises) antes de la alineación para evitar el mapeo cruzado de TARTA-piRNA derivados. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. DGRP, Drosophila Panel de referencia genética piRNA, RPM de ARN pequeño que interactúa con Piwi, lecturas por millón.

S15 Fig. Correlación entre TART-A y nxf2 piRNA.

Existe una fuerte correlación positiva entre TARTA-piRNAs derivados que se alinean con nxf2 versus el nxf2 piRNAs aguas abajo de la región de homología compartida, en 16 cepas de DGRP (rho de Spearman = 0,88, PAG & lt 2.2e-16). Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. DGRP, Drosophila Panel de referencia genética piRNA, ARN pequeño que interactúa con Piwi.

S16 Fig. Las 5 cepas de DGRP utilizadas en el experimento RNA-seq tienen nxf2 niveles de expresión que son representativos de la población DGRP en su conjunto.

Usamos el conjunto de datos de microarrays de [125] para seleccionar 5 cepas DGRP cuya mediana nxf2 El nivel de expresión es similar al de la población DGRP completa. Los datos subyacentes se pueden encontrar en S2 Data. DGRP, Drosophila Panel de referencia genética RNA-seq, secuenciación de RNA.

Tabla S1. Recuentos de alelos específicos para TARTA-piRNA antisentido derivados alineados con nxf2. piRNA, ARN pequeño que interactúa con Piwi.

Datos S1. Alineación de secuencia múltiple de nxf2.

Datos S2. Datos subyacentes para todos los gráficos.

Datos S3. Alineación de secuencia múltiple utilizada para la Fig. 2B.

Datos S4. Archivo FASTA que contiene la secuencia del D. simulanos TART-A fragmento.


G-cuádruplex teloméricos: de humano a Tetrahymena Repite

Las secuencias teloméricas protozoarias y teloméricas humanas difieren sólo en una base purina en sus repeticiones TTAGGG en secuencias teloméricas y TTGGGG en secuencias protozoarias. En este estudio, se analiza y compara la relación entre los G-cuádruplex formados a partir de estas repeticiones y sus derivadas. La secuencia de ADN telomérico humano G3(T2AG3)3 y se investigaron secuencias relacionadas en las que cada base de adenina ha sido reemplazada sistemáticamente por una guanina, el resultado es Tetrahymena repite. La sustitución no afecta la formación de G-quadruplex pero puede causar diferencias en la topología. Los resultados también muestran que la estabilidad de los derivados sustituidos aumentó en secuencias con mayor número de sustituciones. Además, la mayoría de las secuencias que contienen imperfecciones en las repeticiones que se analizaron en este estudio también ocurren en humanos y Tetrahymena genomas. Generalmente, la presencia de estructuras G-quadruplex en cualquier organismo es una fuente de limitaciones durante el ciclo de vida. Por lo tanto, una comprensión más completa de la influencia de la sustitución de bases en la variabilidad estructural de los G-cuádruples tendría un valor científico considerable.

1. Introducción

Las secuencias de ADN ricas en G pueden formar G-cuadruplex intra e intermoleculares basándose en la asociación de una o más hebras de ADN. Los nucleótidos que intervienen entre los recorridos G forman bucles de estructuras G-cuádruplex plegadas que pueden adoptar una variedad de formas topológicas diferentes [1, 2]. Cuando los tractos de guanina están orientados en la misma dirección, los bucles de inversión de cadena doble (hélice) unen dos hebras paralelas adyacentes para formar una estructura paralela [3]. Cuando los tractos de guanina están orientados en direcciones opuestas, los bucles de borde o diagonales unen dos hebras antiparalelas para formar un G-quadruplex antiparalelo [4]. En híbrido antiparalelo o el llamado (

) estructuras, una sola hebra está orientada en una dirección diferente a las demás [5-7]. Un pliegue tipo novedoso () que ha sido descrito recientemente por Marušič et al. exhibe una conformación en la que los tres tipos de bucles se presentan en una conformación: bucles de inversión de cantos, diagonales y de doble cadena [8]. Además, los G-cuádruplex multiméricos intermoleculares pueden formarse mediante la asociación de dos o más hebras [9].

Estas estructuras subrayan el alto grado de polimorfismo estructural G-cuádruplex, un fenómeno que depende de muchos factores diferentes: la longitud y secuencia del ácido nucleico y las condiciones ambientales presentes durante la reacción de plegado, como el tampón, el pH, el catión estabilizador, la temperatura. y la presencia de agentes que causan deshidratación [10-14]. Las secuencias ricas en G con propensión a formar estructuras G-cuádruplex pueden ubicarse en muchas regiones del ADN genómico humano, especialmente en varias regiones biológicamente importantes, incluido el final de los telómeros eucariotas lineales [15, 16]. Sin embargo, las supuestas secuencias ricas en G no se distribuyen aleatoriamente dentro de un genoma, tales secuencias ocurren predominantemente en regiones protooncogénicas (que promueven la proliferación celular) y están agotadas en genes supresores de tumores (que mantienen la estabilidad genómica) [17]. Es muy poco probable que estas supuestas secuencias puedan formar en vivo y la evidencia directa de su existencia en células vivas sigue siendo un tema de discusión [18-20]. Sin duda, las secuencias formadoras de G-quadruplex más estudiadas son las ubicadas en los extremos 3 'de los telómeros humanos. Las secuencias teloméricas y los complejos de nucleoproteínas especializados que cubren los extremos de los cromosomas lineales son esenciales para la estabilidad cromosómica y la integridad genómica [21-23]. Los telómeros de mamíferos consisten en repeticiones en tándem de secuencias ricas en G,

. Varias kilobases de esta secuencia son bicatenarias, pero más de un centenar de nucleótidos permanecen sin aparear y forman salientes 3 ′ monocatenarios [24], un estado que proporcionaría condiciones favorables para la formación de uno o más G-cuádruplex. en vivo [22]. La estructura y estabilidad de los telómeros juegan un papel importante en el desarrollo del cáncer y el envejecimiento celular [25, 26]. También hay evidencia de que los telómeros sirven como un tipo de reloj biológico, ya que las estructuras de los telómeros parecen acortarse con cada ciclo celular sucesivo. En las células inmortalizadas y en las células cancerosas, sin embargo, se activa una telomerasa para mantener la longitud del telómero alargando la secuencia telomérica en los extremos del cromosoma [27, 28]. También se ha demostrado que los G-cuádruplex formados por ADN telomérico humano monocatenario inhiben la actividad de la telomerasa [29], y este descubrimiento ha llevado a un mayor interés en las estructuras como dianas farmacológicas potenciales atractivas [30].

Se ha llevado a cabo una amplia gama de estudios de los G-cuádruplex teloméricos humanos utilizando una amplia variedad de técnicas diferentes [1]. Hasta la fecha, se han identificado estructuras de alta resolución de cuatro topologías de plegamiento distintas con tres capas de tétrada G para las cuatro repeticiones teloméricas humanas [1-7]. Además, también se ha revelado una estructura adicional que consta de solo dos capas de tétrada G que destaca el polimorfismo estructural de los cuádruples G teloméricos [31]. La estructura del ADN telomérico humano en soluciones hacinadas también ha sido investigada por muchos autores [11], pero es probable que esta estructura sea el resultado de la deshidratación más que del hacinamiento molecular [12, 32, 33]. La gran variedad de estructuras identificadas hasta la fecha también se puede atribuir a la presencia de nucleótidos flanqueantes fuera de la secuencia central G3(T2AG3)3 y la concentración de iones y al uso de diferentes métodos y condiciones experimentales [1, 34].

Vorlícková et al. [35-38], y estos estudios anteriores se centraron en la sustitución de guanina por adenina, la introducción de sitios abásicos, 8-oxoadenina en sustitución de adenina y la sustitución de 5-hidroximetiluracilo por timina en repeticiones teloméricas se analizaron [39-41] . Sin embargo, en este estudio se aplica una estrategia opuesta, la sustitución de adenina por guanina (ver Figura 1). El objetivo principal es lograr la conversión total de cuatro repeticiones humanas en Tetrahymena repeticiones que conservan la capacidad de formar G-quadruplex intramolecular. Curiosamente, también se encontraron repeticiones ricas en G que contienen imperfecciones en el ser humano y Tetrahymena genoma, consulte la Tabla 1 y los materiales de apoyo.

coeficiente de extinción a 257 nm.

En este estudio, examinamos las estructuras formadas por el Tetrahymena secuencia telomérica, dG4(T2GRAMO4)3, que se diferencia de la secuencia humana por un único reemplazo de G por A en cada repetición [42]. Dado que Gs son esenciales para la formación de G-quadruplex, hemos sustituido sistemáticamente cada una de las tres adeninas por guaninas en los bucles TTA de la secuencia G-quadruplex que forma G3(T2AG3)3, aumentando así el número de guaninas hasta en tres guaninas por oligonucleótido. Se utilizaron espectroscopía de dicroísmo circular (CD) y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para observar el efecto de la (s) sustitución (es) de base sobre la formación, estabilidad térmica y conformación de G-cuadruplex. Las mediciones se realizaron en presencia de iones tanto Na + como K + y con concentraciones de PEG-200 o acetonitrilo al 0, 15, 30 y 50% en peso a diferentes temperaturas. Además, se verificó y confirmó la formación de estructuras G-quadruplex utilizando Thiazole Orange (TO). TO es una excelente sonda fluorescente de ADN para formas estructurales de ADN debido a su alto rendimiento cuántico de fluorescencia [43]. Este ligando estabiliza la estructura G-quadruplex y también puede inducir cambios topológicos [44, 45]. El complejo G-quadruplex-TO ofrece un perfil característico de espectro de dicroísmo circular inducido en tampones que contienen cationes de sodio [44].

2. Materiales y métodos

Todos los experimentos se llevaron a cabo en un tampón Britton-Robinson modificado (mRB), ácido fosfórico 25 mM, ácido bórico 25 mM, ácido acético 25 mM y complementado con 50 mM de KCl o NaCl, PEG-200 (polietilenglicol con un promedio de peso molecular de 200) y acetonitrilo (Fisher Eslovaquia). El pH se ajustó mediante Tris a un valor final de 7,0. Los oligonucleótidos con las secuencias que se muestran en la Tabla 1 se adquirieron de Metabion international AG. Las muestras de ADN liofilizado se disolvieron en agua bidestilada antes de su uso para dar soluciones madre 1 mM. Las concentraciones de ADN monocatenario se determinaron midiendo la absorbancia a 260 nm a alta temperatura (95 ° C).

2.1. Espectroscopia de CD

Los espectros CD y UV-vis se midieron usando un espectropolarímetro Jasco modelo J-810 (Easton, MD, EE. UU.). La temperatura del soporte de la celda fue regulada por un controlador de temperatura PTC-423L. Las exploraciones se realizaron en un rango de 220 a 600 nm en un volumen de reacción de 300 μl en una cubeta con un recorrido de 0,1 cm y una velocidad de exploración del instrumento de 100 nm / min, paso de 1 nm y ancho de banda de 1 nm, con un tiempo de respuesta de 2 s. Los datos de CD representan tres exploraciones promediadas tomadas en un rango de temperatura de 0 a 100 ° C. Todas las muestras de ADN se disolvieron y diluyeron en tampones adecuados que contenían concentraciones apropiadas de iones y agente deshidratante. La cantidad de oligómeros de ADN utilizados en los experimentos se mantuvo cerca de 25 μM de concentración de cadena de ADN. Las muestras se calentaron a 95 ° C durante 5 minutos y luego se dejaron enfriar hasta la temperatura inicial antes de cada medición. Los espectros de CD se expresan como la diferencia en la absorción molar de la luz polarizada circularmente para diestros y zurdos (Δε) en unidades de M −1 · cm −1. La molaridad estaba relacionada con los oligómeros de ADN. Se obtuvo un espectro de línea base de tampón usando la misma cubeta y se restó de los espectros de la muestra. La estabilidad térmica de los diferentes cuadruplex se midió registrando la elipticidad del CD a 295 y 265 nm en función de la temperatura [14, 46]. La temperatura osciló entre 0 y 100 ° C y la velocidad de calentamiento fue de 0,25 ° C / min. La temperatura de fusión (

) se definió como la temperatura del punto medio de transición. se estimó a partir del valor máximo de la primera derivada de la curva ajustada. La titulación del ADN se realizó con concentraciones crecientes de TO. Se solubilizó TO en DMSO para alcanzar una concentración final de solución madre de 10 mM. La concentración de ADN y TO en una celda de cuarzo de 1 mm fue de 30 μM y 0-200 μM, respectivamente, y el incremento de TO fue

67 μM. Cada muestra se mezcló vigorosamente durante 3 minutos después de la adición de TO CD / Los espectros UV se midieron inmediatamente.

2.2. Electroforesis

Muestras que constan de 0,3 μSe separó 1 mM de soluciones madre usando PAGE no desnaturalizante en un aparato electroforético de temperatura controlada (Z375039-1EA Sigma-Aldrich, San Francisco, CA) en geles de acrilamida al 15% (acrilamida / bisacrilamida 19: 1). Se cargó ADN en

cm geles. La electroforesis se realizó a 10 ° C durante 4 horas a 125 V (

8 V · cm −1). Cada gel se tiñó con StainsAll (Sigma-Aldrich). El gel también se tiñó utilizando el procedimiento de tinción con plata para mejorar la sensibilidad de la visualización del ADN [44].

2.3. Espectroscopia de fluorescencia

Los espectros de fluorescencia se adquirieron con un espectrofotómetro de fluorescencia Varian Cary Eclipse a 22 ± 1 ° C que estaba equipado con un circulador de temperatura controlada. En todos los experimentos se usó una cubeta de cuarzo con una longitud de paso de 3 mm. En las mediciones de fluorescencia, las rendijas de excitación y emisión fueron de 5 nm y la velocidad de exploración fue de 240 nm / min. 66 μM de TO se tituló con ADN (3.3, 6.6 y 13.2 μM) en un tampón mRB tanto en presencia como en ausencia de cationes metálicos monovalentes. Las relaciones molares entre el ADN y el ligando fueron 1:20, 1:10 y 1: 5. La longitud de onda de excitación se ajustó a 452 nm.

3. Resultados y discusión

3.1. Diseño de secuencia y espectros de CD

La secuencia derivada de la secuencia telomérica humana d (G3(T2AG3)3) y se estudian derivados sustituidos en diferentes condiciones. Las secuencias de ADN y las abreviaturas utilizadas en este estudio se resumen en la Tabla 1. Los puntos 1, 2 y 3 indican las posiciones de la sustitución de bases en el primer, segundo y tercer bucle de la secuencia HTR, respectivamente. El punto 0 indica una guanina flanqueante en el extremo 5 'del oligonucleótido, Figura 1. En los oligonucleótidos de ADN derivados de HTR, la guanina (G) -por-adenina (A) en el bucle TTA se sustituyó con la expectativa de que el modificado las secuencias conservarían la capacidad de formar G-cuádruplex de forma espontánea, aunque con topologías diferentes a las que se encuentran en las secuencias HTR. Los derivados de HTR se analizaron en presencia de NaCl 50 mM y KCl, Figura 2. El primer grupo representa oligonucleótidos que contienen solo mutaciones puntuales en diferentes posiciones HTR1, HTR2y HTR3 (líneas negras en la Figura 2). El segundo grupo representa oligonucleótidos que contienen dos mutaciones puntuales (los espectros se indican con azul en la Figura 2). Los dos primeros bucles se modificaron en HTR1,2, el primer y último bucle se cambiaron en HTR1,3 y el segundo y tercer bucles se modificaron en HTR2,3. Oligonucleótidos HTR0,1,3, HTR0,2,3y HTR1,2,3 contenía tres sustituciones de G por A (espectros en verde). El espectro y las temperaturas de fusión del HTR0,1,2 secuencia son muy similares a las del HTR0,2,3 secuencia (no se muestra en este estudio), mientras que el HTR0,1,2,3 La secuencia es equivalente a la secuencia THR.

1 h hasta la temperatura inicial a la que se mantuvo la muestra al comienzo de la medición [14].

Las secuencias sustituidas también se compararon con las secuencias HTR y THR no modificadas. En términos generales, cada uno de los residuos de guanina en cualquier G-run podría estar involucrado en la formación de G-tétradas. En el caso de la formación de cuadrúplex de tétrada G de tres capas, se encontró que las longitudes de los bucles variaron cuando se introdujo la sustitución de bases en la secuencia de HTR, los bucles podrían consistir en tres o cuatro nucleótidos dependiendo de la ubicación y el número de sustituciones. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de la formación de G-cuádruplex de cuatro capas para secuencias que contienen tres sustituciones, pero es importante señalar que tales estructuras tendrían que consistir en al menos una tétrada de heteronucleótidos en la que también está presente la adenina. Hasta la fecha, no se ha determinado la estructura 3D de secuencias THR de longitud completa en presencia de potasio; la única faceta de la estructura que se conoce es la estructura tetramérica G-cuádruplex formada a partir de cuatro secuencias más cortas d (TTGGGGT) (PDB: 139D) [47]. Esta estructura consta de cuatro G-tétradas y no se puede afirmar que represente la estructura real de un oligonucleótido de longitud completa. Sin embargo, la estructura 3D de THR se ha determinado sólo en presencia de sodio (PDB: 186D) [48]. Esta estructura consta de tres tétradas G apiladas, dos bucles de borde y un bucle de inversión de cadena doble. A pesar de que las secuencias de THR y HTR difieren en solo uno de los seis nucleótidos, sus topologías 3D son bastante diferentes porque HTR en sodio adopta una estructura de tétrada de tres G que consta de dos bucles de borde y un bucle diagonal central (PDB: 143D) [4]. Sin embargo, la secuencia HTR también puede adoptar una conformación de tipo cesta estable en presencia de potasio que consta de sólo dos capas de tétrada G (PDB: 2KF8) [31].

Hasta la fecha se han identificado varias secuencias de HTR de origen natural. Las formas 1 (PDB: 2HY9) y 2 (2JPZ) constan de tres tétradas G, pero el orden de los bucles es diferente. HTR forma una inversión de doble cadena y dos bucles de borde en ambas formas [49, 50]. Existe cierta similitud con los THR G-quadruplex que se forman en solución en presencia de sodio [48]. La forma 3 está representada por un G-cuádruplex paralelo con tres bucles de inversión de cadena doble (PBD: 1KF1) [3]. Recientemente, Lim et al. también han confirmado la estructura de un derivado de HTR de 27 nt en presencia de sodio que difiere significativamente de los mencionados anteriormente (PBD: 2MBJ) [1]. Aunque ambas estructuras HTR conocidas resueltas en sodio poseen las mismas orientaciones relativas de hebra, difieren en las direccionalidades de los enlaces de hidrógeno y en la disposición del bucle. La estructura 2MBJ nuevamente consta de dos bucles de inversión de canto y uno de doble cadena.

La secuencia derivada del telómero de Oxytricha d [G4(T4GRAMO4)3] (PDB: 201D y 230D) adopta una estructura con tipos de bucles similares a los que se encuentran en HTR en sodio, dos bucles diagonales de borde y uno central [4, 51, 52]. Sin embargo, la secuencia de Oxytricha forma un cuádruplex G-tetrad de cuatro capas. En el momento de escribir este artículo, la estructura de la solución de la secuencia de Oxytricha d [G4(T4GRAMO4)3] en solución que contiene K + aún no se ha determinado. La principal razón de esto podría ser el hecho de que esta secuencia y la THR en presencia de potasio pueden adoptar diferentes formas topológicas que coexisten en solución y se observan bandas adicionales durante la separación electroforética [14]. Curiosamente, los G-quadruplex de cuatro capas son muy estables y presentan temperaturas de fusión particularmente altas en presencia de potasio [14]. Recientemente, la estructura de d (GGGGCC)4 en presencia de potasio también se ha determinado que la secuencia contiene citosinas en lugar de residuos de timina y una 8-bromodesoxiguanosina (PDB: 2N2D) [53]. La estructura G-quadruplex adoptada por esta secuencia podría estar estrechamente relacionada con la de THR en potasio. Esta estructura antiparalela se compone de cuatro cuartetos G que están conectados por tres bucles C-C de borde. Los resultados de los espectros de CD muestran muchas firmas en común con la secuencia THR. Una de las citosinas en cada bucle se apila sobre el cuarteto G, una disposición que da como resultado una estructura muy compacta y estable. De manera similar, la temperatura de fusión de la estructura es superior a 90 ° C.

En general, se acepta que la espectroscopia de CD es un método muy útil y rentable para ofrecer un primer vistazo a la arquitectura de los G-cuádruplex plegados. Los espectros de CD de G-quadruplex se pueden utilizar para indicar si el ADN se ha plegado en una conformación paralela o antiparalela [36, 54].

Aunque hay hasta 25 topologías de plegamiento genéricas de G-quadruplex, es posible clasificar las estructuras en tres grupos basándose en la secuencia de ángulos de enlace glicosídico adoptados por las guanosinas del G-quadruplex [55]. El grupo I consta de G-cuadruplex paralelos con hebras orientadas en la misma dirección y con guanosinas de los mismos ángulos de enlace glicosídico. Los G-cuádruplex paralelos (Grupo I) comparten las mismas características independientemente de que contengan tres o cuatro bucles: un máximo positivo intenso en

240 nm. Los grupos II y III consisten en G-cuádruplex antiparalelos El grupo II se puede caracterizar por guanosinas de ángulos de unión glicosídicos en orientaciones tales como anti-anti y syn-syn y también syn-anti y anti-syn, mientras que el Grupo III consta de guanosinas apiladas de distintos ángulos de enlace glicosídico. Los G-cuádruplex antiparalelos muestran una banda positiva en

295 nm. Señales de CD positivas y negativas en

240 nm, respectivamente, son característicos del Grupo II, mientras que el Grupo III muestra picos inversos. En contraste, los espectros de CD de la arquitectura G-cuádruplex de alto orden de las formas del Grupo III exhiben señales negativas y positivas a 240 nm y

Los perfiles de CD correspondientes a distintas conformaciones de G-cuádruple se determinan empíricamente, por lo tanto, la interpretación de los espectros de CD de las supuestas secuencias de G-cuádruple desconocidas puede ser ambigua. Una serie de otros factores también pueden causar cierto grado de incertidumbre sobre la evaluación de los espectros de CD, incluida, por ejemplo, la presencia de poblaciones mixtas de varios confórmeros y / o la presencia de conformaciones multiméricas en solución [9, 14, 44, 46 ].

Las mediciones de CD muestran claramente que las sustituciones de G por A tuvieron un impacto considerable en el perfil espectral de cada secuencia. La presencia del andamio G-quadruplex formado a partir de la secuencia HTR no modificada se caracteriza por un pico positivo en

295 nm con dos hombros alrededor

250 nm en presencia de potasio (Figura 2 (a), línea roja). Según los espectros de CD, estas firmas son características de los G-cuádruplex antiparalelos del Grupo II. Este espectro es indicativo de la formación de una estructura tipo cesta de dos capas [31, 55]. La secuencia HTR adopta una conformación G-cuádruplex antiparalela clara de tipo Grupo II en presencia de sodio (Figura 2 (d), línea roja). La estructura se caracteriza por un gran máximo positivo en

295 nm, uno más pequeño cerca

245 nm, y un pico de CD negativo en

265 nm. Estudios anteriores han informado de que estas secuencias forman un G-quadruplex antiparalelo intramolecular de tipo canasta [4]. Cada secuencia muestra un pico claro en

295 nm que es característico de una topología G-cuádruplex antiparalela. El primer conjunto de oligómeros con una única sustitución por oligonucleótido en presencia de potasio muestra dos picos separados en

265 nm, la señal es dominante a 295 nm (los espectros se muestran en negro). Sin embargo, los derivados de THR y HTR que contienen una o más sustituciones de G por A en presencia de potasio muestran un aumento del pico en

265 nm (Figuras 2 (b) y 2 (c)). Esto indica la coexistencia de más de una estructura topológica, es decir, configuraciones paralelas y antiparalelas ver también los resultados electroforéticos en la Figura 7. Se observó que el polimorfismo estructural aumentaba con un número creciente de G en la secuencia de ADN. La señal de CD en

265 nm (espectros mostrados en verde) fue predominante para los oligonucleótidos que contienen tres sustituciones (Figura 2 (c)).

En presencia de sodio, solo el HTR2 La secuencia con una sustitución en el segundo bucle exhibió un espectro de CD idéntico al de HTR, aunque incluso esta correspondencia mostró amplitudes más bajas (espectros en negro punteado en la Figura 2 (d)). HTR1 y HTR3 Las secuencias con sustituciones en el primer y tercer bucle, respectivamente, también mostraron un máximo positivo a 295 nm, pero los picos negativos a 265 nm fueron menos profundos y ligeramente desplazados hacia longitudes de onda más largas en comparación con los resultados de la secuencia sin modificar. A pesar de estas diferencias, es probable que formen G-cuadruplex del Grupo III. Solo los espectros de CD de la secuencia THR muestran firmas de tipos del Grupo II.

Las muestras en el segundo grupo exhibieron un máximo positivo en

295 nm con un ligero cambio a longitudes de onda más bajas en el caso de HTR1,2 y HTR1,3 (Grupo III, espectros mostrados en azul en la Figura 2 (b)). Estas dos secuencias mostraron una falta de un pico negativo a 265 nm, y el pico positivo más pequeño a alrededor de 245 nm se desplazó ligeramente a longitudes de onda más largas (Figura 2 (e)). HTR2,3 muestra una señal negativa en

245 nm y una señal positiva a 265 y 295 nm, resultados que son indicativos de la formación de G-cuádruplex antiparalelos del Grupo II.

Los espectros de CD de HTR0,2,3 están cerca de los del grupo II G-quadruplex mientras que el CD de HTR0,1,3 y HTR1,2,3 se asemejan a los de los G-cuádruplex del Grupo III. Todas las muestras con tres mutaciones exhibieron un máximo positivo en

295 nm. HTR0,1,3 exhibe señales negativas a 235 y 275 nm en presencia de sodio (Figura 2 (f)), mientras que HTR0,2,3 muestra señales positivas a 265 y 295 nm.

En general, se observó que todas las secuencias modificadas en presencia tanto de Na + como de K + diferían en cierto grado del espectro HTR y también se encontró que diferían entre sí. Los perfiles espectrales de CD variables de una muestra a otra son el resultado de ligeros cambios en la topología G-quadruplex. Sin embargo, no fue posible determinar ni el grupo ni la estructura de los G-quadruplex con ningún grado de certeza sobre la base de los perfiles espectrales de CD solo debido a la coexistencia de varias formas topológicas, un hallazgo que fue confirmado por los resultados electroforéticos discutidos. en la Sección 3.5.

3.2. CD Spectra en presencia de PEG-200 y acetonitrilo

En presencia de K +, se sabe que el agente deshidratante PEG-200 induce un cambio conformacional de los G-cuádruples teloméricos, principalmente la transición de una estructura antiparalela a una disposición paralela [2, 9, 11, 13, 14, 56] . Por lo tanto, también se investigó la influencia de PEG-200 y otro agente deshidratante acetonitrilo en los resultados espectrales de CD y la estabilidad de los derivados de HTR. Los espectros de CD representativos de HTR y THR en presencia de diferentes concentraciones de ambos agentes deshidratantes (15, 30 y 50% en peso) y KCl 50 mM se muestran en la Figura 3. Se encontró que ambos tipos de ADN forman estructuras G-cuádruplex. con una disposición paralela a modo de hélice en presencia de K +. Sin embargo, cuando las secuencias se estudiaron en presencia de sodio sin potasio presente, no se observaron conversiones estructurales, este hallazgo permaneció constante para todos los derivados de HTR y THR estudiados. Curiosamente, a una concentración de PEG-200 del 50% en peso, se encontró que los picos positivos a 295 nm desaparecían y se registró una señal de CD a 265 nm que fue

2 veces más alto que sin la presencia de PEG-200. Se observó el mismo efecto para el acetonitrilo. Ésta es una propiedad intrínseca de cualquier molécula G-cuádruplex convertida. En un estudio reciente, nuestro grupo presentó una hipótesis que explica este hecho de que la señal de CD depende del número y la orientación de los enlaces de glicosilo apilados [9, 14, 57]. También hemos demostrado previamente que PEG-200 provoca la dimerización de HTR [9], por lo que también se realizó un análisis electroforético de las secuencias en presencia de PEG-200, Figura 8.

Se sabe que la temperatura de fusión del HTR y la gran mayoría de las estructuras G-quadruplex aumentan en presencia de PEG-200. Para verificar este hecho, las temperaturas de fusión se determinaron en presencia de PEG-200 sobre la base de curvas de fusión CD. Los resultados se resumen en la Tabla 2 y confirman claramente que el PEG-200 aumenta las temperaturas de fusión de los derivados de HTR. En una metodología, que se ha utilizado en nuestros estudios anteriores, se realizaron mediciones de longitud de onda dual para los casos en los que los espectros mostraban picos a 295 y 265 nm, respectivamente [9, 11]. Se obtuvo una A de 63,2 ° C en un tampón mRB que contenía KCl 50 mM, en comparación con un valor de 50,4 ° C en un tampón con NaCl 50 mM para HTR a 295 nm. La imagen general que surge de los datos termodinámicos es que la estabilidad de los G-cuadruplex de los derivados de HTR aumenta con un mayor número de sustituciones de G por A en las soluciones de Na + y K +. El valor más bajo de HTR se registró tanto en KCl 50 mM como en NaCl 50 mM. Se encontró que la concentración de derivados de HTR era mayor en KCl que en NaCl. Todas las secuencias estudiadas muestran un valor superior en presencia de ambos agentes deshidratantes. Los resultados indican que PEG-200 estabiliza G-quadruplex con o sin la mutación A-for-G. Las temperaturas de fusión propuestas resumidas en la Tabla 2 demuestran claramente que tanto el número de residuos de guanina en un tracto G como la naturaleza del ion estabilizador son factores determinantes importantes en la estabilidad térmica de los G-quadruplex.

3.3. Mediciones de titulación

Nuestro grupo ha desarrollado recientemente una nueva metodología experimental para la identificación de secuencias formadoras de G-quadruplex utilizando el tinte de cianina Thiazole Orange (TO). TO es una excelente sonda fluorescente de ADN para varios motivos estructurales debido a su alto rendimiento cuántico de fluorescencia [58]. Esta técnica experimental también se puede utilizar para investigar la hipótesis de que los derivados de HTR adoptan conformaciones G-quadruplex. TO interactúa con varias estructuras secundarias de ADN, pero tiene una afinidad de unión más fuerte a las estructuras triplex y G-quadruplex que a otros motivos estructurales [43, 45]. Aunque TO es ópticamente inactivo, los complejos TO-quadruplex son quirales y muestran un perfil único del espectro de CD inducida (ICD) en la región visible [44]. Recientemente, hemos descrito las características comunes del ICD que comparten muchas estructuras G-quadruplex diferentes. Los resultados de la interacción TO-quadruplex son los picos positivos a 265 y 295 nm (rango UV), y los tres picos en la región visible en

473 nm en la solución sin la presencia de cationes metálicos o en presencia de Na + [44]. TO facilita la formación de estructuras G-quadruplex incluso sin la presencia de otros cationes, pero la topología adoptada inducida con TO puede variar en comparación con la presencia de sodio o potasio en solución, el perfil de CD en la región UV puede ser diferente. Se observó un perfil ICD completamente diferente del complejo TO-DNA para secuencias incapaces de adoptar la estructura G-quadruplex [44]. Sin embargo, otros ligandos G-quadruplex probados en nuestro laboratorio no eran adecuados para este propósito y proporcionaron resultados ambiguos, por ejemplo, Thioflavin T, derivados de porfirina, Hoechst 33342 y Hoechst 33258. Esta metodología está destinada a utilizarse como técnica complementaria porque amplía las posibilidades de los métodos espectrales básicos en términos de distinguir estructuras G-quadruplex sin el uso de métodos más costosos y que requieren más tiempo. La monitorización ICD se puede aplicar en diferentes condiciones, pero es la más sensible en soluciones sin la presencia de cationes metálicos, también se puede aplicar con sensibilidad ligeramente reducida en soluciones que contienen Na + o bajas concentraciones de K + (& lt5 mM). Cabe señalar aquí que la interpretación del perfil de ICD a una concentración más alta de K + no es de ninguna manera inequívoca. Sin embargo, también realizamos los experimentos de titulación en presencia de KCl 50 mM porque esta condición es más relevante biológicamente.

Los resultados del análisis de titulación en presencia de NaCl 50 mM se muestran en la Figura 4. Los resultados del ICD muestran las señales positivas esperadas en

510 nm y señales negativas en

475 nm, firmas que son características de los G-quadruplex. Además, se analizó la secuencia de G4C2 debido a su estructura 3D en soluciones que contienen potasio. Como era de esperar, también se encontró que este oligonucleótido forma G-cuadruplex en las condiciones dadas. Las señales correspondientes a las de las estructuras G-quadruplex antiparalelas también se detectaron claramente en la región UV. Al aumentar la concentración de TO, se observó que las señales a 295 y 265 nm disminuían y aumentaban, respectivamente, fenómenos que son indicativos de una conversión de plegamiento antiparalelo a paralelo. Este efecto también se observó bajo la influencia de PEG-200, Figura 3.

Como se señaló anteriormente, también se realizaron mediciones de titulación en KCl 50 mM, Figura 5.Las señales observadas en la región UV sugieren claramente que las estructuras G-quadruplex se formaron en presencia de potasio, pero el efecto de la conversión estructural se suprimió significativamente. Se sabe que una señal ICD intensiva con un máximo de alrededor de 500 nm corresponde a la formación de complejos entre el ADN y los ligandos. Sin embargo, hubo una clara falta de cualquiera de las características comunes claras que se observan típicamente para los perfiles obtenidos en presencia de sodio. Curiosamente, el ICD de la secuencia THR se invirtió y, por lo tanto, sugerimos que el modo de unión de TO con THR es diferente al de los derivados de HTR. Otra explicación es que THR forma al menos dos conformaciones topológicas distintas en solución y que una de estas formas puede unirse con TO de forma más eficaz. Como se informó en nuestro estudio anterior, THR forma al menos tres estructuras diferentes en presencia de potasio [14], por lo que decidimos verificar esta hipótesis mediante la separación electroforética.

Es importante excluir el posible efecto secundario del uso de DMSO durante los experimentos de titulación de TO. La solución madre de TO contiene DMSO, un disolvente aprótico polar que puede producir un efecto similar al de PEG-200 [56]. La concentración de DMSO utilizada en nuestros experimentos no superó el 4,5% en peso. Para eliminar el efecto deshidratante que el DMSO puede causar en los experimentos de titulación de TO, el análisis de titulación también se realizó en presencia de DMSO solo. Sin embargo, no se observó ningún efecto significativo a concentraciones inferiores al 5% en peso en ausencia de Na +, K + e iones. Sin embargo, la presencia de DMSO en solución que contiene K + podría explicar las ligeras diferencias en los perfiles de ICD a concentraciones de K + superiores a 5 mM.

3.4. Análisis de fluorescencia

Los complejos DNA-TO muestran una absorción clara pero amplia a alrededor de 500 nm. Se observó un solo pico positivo de TO a 452 nm y esta longitud de onda se utilizó para la excitación del complejo ADN-TO. Los espectros de fluorescencia de las secuencias HTR y THR se muestran en la Figura 6. Las mediciones se realizaron en tres entornos diferentes: (i) un tampón mRB sin cationes metálicos, (ii) un tampón mRB suplementado con NaCl 50 mM, y (iii) mRB suplementado con KCl 50 mM. Para ambos oligómeros, la mejora de la fluorescencia logró el mayor rendimiento en la solución sin cationes metálicos. El rendimiento de fluorescencia de HTR fue mayor que el rendimiento de THR en las tres condiciones probadas. El objetivo de este experimento fue demostrar que el perfil de fluorescencia no depende en gran medida de la secuencia del oligonucleótido de ADN para este ligando. El aumento de la fluorescencia de TO puede inducir la formación de cualquier tipo de estructura G-quadruplex.

3 μMETRO). La línea S representa la movilidad de la mezcla de oligonucleótidos: d

3 μMETRO). El tampón de carga contenía 50% en peso de PEG-200.

3.5. Electroforesis en presencia de Na +, K + y TO

La electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) es una técnica accesible que se utiliza para complementar los datos espectroscópicos cuando la presencia de múltiples especies de G-cuádruplex no puede identificarse fácilmente basándose únicamente en los espectros de CD. La movilidad de la muestra de ADN depende de muchos factores diferentes, incluida la conformación, la carga y la masa molecular. La separación electroforética puede proporcionar información valiosa sobre la molecularidad de los G-quadruplex. Los G-cuádruples intramoleculares tienen una estructura compacta y, por lo tanto, migran más rápido a través de un gel que contiene cationes que sus contrapartes lineales, mientras que los G-cuádruples intermoleculares migran más lentamente debido a su mayor peso molecular [9, 14, 44]. Oligómeros d (AC)9, d (AC)14yd (AC)18 fueron utilizados como estándares debido a su falta de estructuras secundarias. Estos estándares sirvieron como puntos de referencia para comparar la movilidad de diferentes patrones electroforéticos. Dado que ninguna de las secuencias utilizadas tenía más de 22 nt., Los oligonucleótidos que se observó que habían migrado más rápido que d (AC)9 podría identificarse como habiendo formado G-cuádruplex intramoleculares. También es razonable suponer que los oligonucleótidos que se movieron más lentamente o a una velocidad similar ad (AC)18 había adoptado estructuras G-quadruplex de alto orden. La Figura 7 muestra los registros electroforéticos de geles nativos de poliacrilamida al 15% que ilustran las movilidades relativas de los oligómeros en presencia de NaCl y KCl 50 mM a 10ºC (Figuras 7 (a) y 7 (c)). Además, los resultados electroforéticos correspondientes, donde los geles y los tampones de carga contienen 2 equivalentes molares de TO, se muestran en las Figuras 7 (b) y 7 (d). En general, surgen algunas tendencias claras. La electroforesis en gel realizada en presencia de sodio muestra que todos los oligonucleótidos se habían movido en un solo volumen, con bandas individuales que migraban más rápido que d (AC)18 en cada columna. Este efecto también se observó cuando TO estaba presente en el gel. Estos resultados indican que todos los oligonucleótidos de ADN forman G-cuádruplex intramoleculares antiparalelos en estas condiciones. Estos resultados coinciden con los obtenidos por espectroscopia de CD. Es importante señalar que las estructuras intramoleculares se habían formado exclusivamente en presencia de sodio a pesar de la introducción de mutaciones en las secuencias de HTR aumentando la posibilidad de la formación de diferentes topologías de G-quadruplex. La electroforesis no reveló ninguna movilidad anómala significativa de secuencias de oligómeros con la misma longitud que se movían más o menos igualmente.

En contraste con el sodio, la presencia de potasio condujo a la formación de arreglos intra e intermoleculares (Figuras 7 (b) y 7 (d)). En el primer grupo, el HTR1 quadruplex con una sustitución en el primer bucle exhibió la banda de migración más rápida en comparación con la de HTR. También se observó una sola banda de frotis para el HTR2 secuencia. Las manchas surgen típicamente cuando se pueden formar dos confórmeros distintos. Una isomerización lenta entre los dos confórmeros durante la separación electroforética es la principal fuente de manchas de la banda. La movilidad del HTR y HTR3 las secuencias con sustituciones en el tercer bucle son similares. Los oligonucleótidos que contienen dos sustituciones por oligómero mostraron altos niveles de polimorfismo. Estos oligonucleótidos forman varios confórmeros coexistentes porque cada línea contiene varias bandas que se mueven a diferentes velocidades. Curiosamente, el HTR1,2 y HTR1,3 las secuencias mostraron dos bandas más rápidas bien reconocidas, resultados que corresponden a la formación de confórmeros intramoleculares, y bandas más lentas que representan estructuras multiméricas. La adición de TO también provocó la fusión de los conformadores más rápidos y la disminución de las estructuras más lentas. HTR2,3 produjo una especie intramolecular más rápida e intermolecular más lenta (dímero y tetrámero). Sorprendentemente, se encontró que los oligonucleótidos con tres sustituciones por oligómero eran ligeramente menos polimórficos en comparación con las secuencias que contienen dos sustituciones, mostrando solo bandas con magnitudes más bajas correspondientes a la formación de G-cuádruplex de múltiples moléculas en el caso del HTR.0,1,3 y HTR1,2,3 secuencias. Se encontró que TO ejerce sólo un efecto limitado sobre las formas multiméricas de estos oligonucleótidos.

3.6. Electroforesis en presencia de PEG-200

La dependencia de la dimerización de HTR en la concentración de PEG 200 se ha analizado en estudios anteriores [9]. Se observó la formación tanto de dímeros intermoleculares como de monómeros intramoleculares en el tampón que contenía una concentración de PEG-200 del 15% en peso. Se observó que los derivados de HTR que contenían 2 y 3 sustituciones se convertían fácilmente en estructuras diméricas de migración más lenta incluso a concentraciones más bajas de PEG-200. A una concentración de PEG-200 de 50% en peso y KCl 50 mM, se indujo la conversión estructural completa a un G-quadruplex dimérico paralelo, Figuras 3 y 8. Este efecto no se observó en tampones que no contenían potasio [9, 14 ]. Las mediciones de CD al 50% en peso de PEG-200 no mostraron señal en

295 nm. Según nuestros estudios anteriores, las especies intermoleculares que migran más lentamente son indicativas de la formación de dímeros [2, 9, 14]. La estructura 3D de HTR que contiene una secuencia flanqueante en una condición analógica se ha determinado mediante RMN [11]. Los resultados muestran una estructura G-cuádruplex paralela intramolecular (PDB: 2LD8), pero los nucleótidos que sobresalen pueden causar un impedimento estérico para la dimerización de esta estructura.

4. Conclusión

En este estudio, demostramos claramente que el aumento del número de guaninas en las regiones de bucle de las secuencias de HTR apoya la formación de estructuras G-quadruplex. Cualquier sustitución de A por G aumenta la temperatura de fusión, mientras que la introducción de varias sustituciones facilita la coexistencia de varios confórmeros en presencia de potasio. La introducción sistemática de estas sustituciones conduce finalmente a la formación de secuencias que ocurren en el Tetrahymena telómero. Además, también se encontraron secuencias similares en el genoma humano. Estos hallazgos plantean un punto interesante. ¿Por qué el Tetrahymena ¿Los telómeros requieren secuencias que puedan adoptar estructuras G-cuádruplex tan estables? En general, los G-quadruplex muy estables suelen ser una fuente de problemas en las células durante el ciclo de vida de un organismo. La secuencia THR es más polimórfica que HTR, forma dos conformadores monoméricos y uno diméricos diferentes, como se ha demostrado aquí y en nuestros estudios anteriores [14]. Nuestro análisis se centró en secuencias que constan de cuatro carreras G sin ningún nucleótido sobresaliente en ambos extremos, este tipo de disposición no es un modelo ideal para la extrapolación a repeticiones teloméricas naturales que normalmente constan de decenas a miles de repeticiones.

Nuestros resultados demuestran que todos los derivados de HTR, incluido el THR, pueden convertirse de pliegues antiparalelos en pliegues paralelos en presencia de potasio y PEG-200. Los espectros ICD indican que el modo de unión de TO con THR en presencia de KCl podría ser diferente de los observados para los derivados de HTR, y este es un hallazgo que también podría ser importante para otras moléculas que reconocen la estructura de THR en la naturaleza. Sugiere que la estructura de THR muestra algunas características estructurales que son diferentes de las de HTR y derivados de HTR en presencia de potasio. La confirmación del significado biológico de este hecho sigue siendo un tema abierto.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación y Desarrollo de Eslovaquia en virtud de los Contratos núms. APVV-0280-11 y APVV-0029-16, Cooperación europea en ciencia y tecnología (COST CM1406), Agencia Eslovaca de Becas (1/0131/16 y 002UPJŠ-4/2015) y becas universitarias internas (VVGS-PF-2017 -251 y VVGS-2016-259). Los autores agradecen a G. Cowper por la lectura crítica y la corrección del manuscrito.

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  54. J. Kypr, I. Kejnovská, D. Renčiuk y M. Vorlíčková, "Dicroísmo circular y polimorfismo conformacional del ADN", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 37, no. 6, págs. 1713–1725, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  55. A. I. Karsisiotis, N. M. Hessari, E. Novellino, G. P. Spada, A. Randazzo y M. Webba Da Silva, "Caracterización topológica de ácidos nucleicos G-cuádruples por absorción UV y dicroísmo circular", Edición internacional Angewandte Chemie, vol. 50, no. 45, págs. 10645–10648, 2011. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  56. D. Miyoshi, T. Fujimoto y N. Sugimoto, "El apiñamiento molecular y la regulación de la hidratación de la formación de G-quadruplex", Temas de la química actual, vol. 330, págs. 87–110, 2013. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  57. D. M. Gray, J.-D. Wen, C. W. Gray et al., "Espectros de CD medidos y calculados de cuartetos G apilados con polaridades iguales o opuestas", Quiralidad, vol. 20, no. 3-4, págs. 431–440, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  58. C. Allain, D. Monchaud y M.-P. Teulade-Fichou, "FRET con plantilla de ADN G-quadruplex: una interacción ternaria específica utilizando un par original de socios donantes / aceptores", Revista de la Sociedad Química Estadounidense, vol. 128, no. 36, págs. 11890–11893, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico

Derechos de autor

Copyright & # xa9 2017 Erika Demkovi & # x10dov & # xe1 et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de células

Los fibroblastos de prepucio BJ se cultivaron en una mezcla 4: 1 de DMEM y medio 199 que contenía suero de ternera suplementado con hierro al 10% (Hyclone, Logan, UT) y gentamicina (25 μg / ml Sigma, St. Louis, MO) a 37 ° C en 5% CO2. Aproximadamente 30 duplicaciones antes de la senescencia, algunas células se infectaron con un retrovirus pLXSN que expresaba las proteínas E6 y E7 de HPV16 (Halbert et al., 1992) y se seleccionó con G418 (400 μg / ml) durante 10 a 14 días.

Preparación de la propagación en metafase y análisis citogenético

Las células se incubaron con colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 4 h, se tripsinizaron, se trataron con tampón KCl hipotónico (0,075 M) durante 30 min a 37 ° C y se lavaron varias veces con metanol-ácido acético (3: 1) hasta que Se obtuvo un sedimento de glóbulos blancos limpio. Los gránulos se almacenaron a -20 ° C hasta que se dejaron caer sobre portaobjetos y se colocaron bandas GTG utilizando métodos estándar (Gustashaw, 1997). Las imágenes en metafase se analizaron utilizando el software CytoVision (Applied Imaging, San José, CA) en el laboratorio de citogenética, University of Texas Southwestern Medical Center.

Hibridación in situ de fluorescencia y análisis comparativo de hibridación genómica

Los portaobjetos de un día se rehidrataron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,5) durante 15 min a temperatura ambiente, se fijaron en formaldehído al 4% en PBS durante 2 min y luego se lavaron en PBS tres veces durante 5 min. Los portaobjetos se trataron con pepsina (1 mg / ml, pH 2,0) a 37ºC durante 10 min y se lavaron dos veces durante 2 min en PBS. Los portaobjetos se fijaron de nuevo en formaldehído durante 2 min, se lavaron en PBS tres veces y luego se deshidrataron mediante incubaciones en serie de 2 min en etanol al 70, 90 y 100% y se secaron al aire. Los portaobjetos se desnaturalizaron durante 10 min a 78 ° C en una mezcla de hibridación (20 μl) que contenía formamida al 70%, 15 ng conjugado con 3′-Cy3 (CCCTAA)3 2′-desoxioligonucleótido N3'-PAG5′ Sonda telomérica de fosforamidato, reactivo de bloqueo al 0,25% (peso / volumen) (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) y MgCl al 5%2 en Tris 10 mM, pH 7,2, y luego se recoció durante 2 ha temperatura ambiente. Después de dos lavados con formamida al 70%, albúmina de suero bovino al 0,1% y Tris 10 mM, pH 7,2, y dos lavados con NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05% y Tris 0,05 M, los portaobjetos se deshidrataron mediante una serie de 2 min. incubaciones en etanol y secadas al aire en la oscuridad. A continuación, los portaobjetos se hibridaron sin desnaturalización en la misma solución de hibridación anterior pero que contenían el oligonucleótido telomérico complementario (conjugado con 3'-Cy3 (TTAGGG)3 2′-desoxioligonucleótido N3'-PAG5Sonda telomérica de fosforamidato de ′, durante 2 ha temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron de nuevo usando los mismos pasos de lavado anteriores, se deshidrataron mediante una serie de etanol y se secaron al aire en la oscuridad. Los cromosomas se contratiñeron con Vectashield que contenía 4,6-diamidino-2-fenilindol-dihidrocloruro (DAPI, concentración final de 0,6 µg / ml, Vector Laboratories, Burlingame, CA) para la identificación de los cromosomas.

Las diapositivas se escanearon y los pliegos de metafase se encontraron automáticamente utilizando el modo Msearch del sistema de software Metafer (MetaSystem Hard and Software, Altlussheim, Alemania). Las imágenes en metafase se capturaron automáticamente como 90 pilas separadas por 0,2 μm mediante un microscopio Zeiss Axioplan 2 (63 ×, 1,4 NA Plan-Apochromat objetivo de inmersión en aceite Thornwood, NY) con conjuntos de filtros de paso único Cy3 y DAPI utilizando el modo AutoCapt del Metafer sistema de software. La imagen DAPI invertida de cada extensión de la metafase se cariotipificó utilizando el sistema de análisis de imágenes digitales ISIS (MetaSystem) y la intensidad de la señal de los telómeros se midió mediante el software de análisis CGH modificado (MetaSystem). Los extremos de los telómeros se interpretaron como extremos sin señal de los telómeros cuando la proporción de rojo (telómero) a azul (DAPI) era cero (Figura 1).

Figura 1. Identificación de los telómeros más cortos. Las metafases de BJ en PD84 se hibridaron en serie con sondas teloméricas ricas en C y G para maximizar la detección de regiones teloméricas pequeñas. (A) Los telómeros tan cortos que no dieron una señal observable (extremos sin señal) se identificaron mediante análisis CGH. (B) La frecuencia de los extremos sin señal por 100 metafases se muestra para todos los extremos teloméricos a partir de un análisis de 403 metafases. En el análisis que se muestra en la Figura 2 se utilizaron BACs dentro de los 100 kb de los extremos de los telómeros indicados por flechas verticales.

Para estudios de fluorescencia de dos colores de repeticiones de variantes teloméricas, 20 ng de la sonda variante de secuencia telomérica (ya sea conjugada con Cy3 (TCAGGG)3 o (TGAGGG)3 2′-desoxioligonucleótido N3'-PAG5′ Fosforamidato) se combinó con 15 ng conjugado con 3′-FITC (TTAGGG)3 2′-desoxioligonucleótido N3'-PAG5′ Fosforamidato y procesado como anteriormente con un paso de desnaturalización de 10 min y una hibridación de 16 h a 37 ° C. Después del lavado y la tinción con DAPI, se capturaron digitalmente las extensiones de metafase con conjuntos de filtros de paso de banda Cy3 / FITC / DAPI de precisión.

Análisis de hibridación de inmunofluorescencia y fluorescencia in situ

Las células se cultivaron en portaobjetos con cámara de vidrio durante al menos 96 h antes de la inmunotinción para las proteínas γH2AX y 53BP1 para minimizar el estrés que surge durante la tripsinización. Las células se lavaron brevemente con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% recién preparado en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS, las células se permeabilizaron durante 15 min con PBS que contenía Triton X-100 al 0,2%, se bloquearon durante 1 h con suero de cabra al 1,5% (Vector Laboratories) en PBS y se tiñeron dos veces con 50 ng / μl de monoclonal de ratón. anti-53BP1 (proporcionado amablemente por el Dr. Chen, Mayo Clinic) y 10 ng / μl de antifosfo-H2AX de conejo (Ser 139 Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a 37 ° C durante 1 h. Posteriormente, las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y se incubaron durante 1 h con anticuerpos anti-conejo conjugados con Alexa Fluor 568 (1: 200) y anti-ratón conjugados con Alexa 488 (1: 200 Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA Sondas moleculares, Eugene, OR) a temperatura ambiente. Después de lavar las células tres veces durante 5 min con PBS, las células se deshidrataron mediante una serie de etanol (70, 90 y 100%) durante 1 min cada una y se contratiñeron con Vectashield que contenía DAPI para identificación nuclear. Los portaobjetos se escanearon y los núcleos positivos se encontraron y capturaron automáticamente con un microscopio Zeiss Axioplan 2 (objetivo de inmersión en aceite 63 ×, 1.4 NA Plan-Apochromat) con conjuntos de filtros de paso único Texas Red, FITC y DAPI utilizando el modo AutoCapt de el sistema de software Metafer. Las imágenes se guardaron como noventa pilas z separadas por 0,2 μm.

Luego, los portaobjetos se procesaron para el análisis de hibridación in situ de fluorescencia (FISH) utilizando las sondas BAC RP3-416J7 (6pter), RP11-1197K16 (17qter), RP4-764O12 (7qter), RP11-1260E13 (17pter), RP11-974F22 ( 9qter) y RP11-81L3 (9q21, 62 Mb del 9qter Children's Hospital Oakland Research Institute). Todos los BAC excepto el 9q21 estaban dentro de los 100 kb del telómero. Los ADN de BAC se extrajeron utilizando un kit de construcción grande (Qiagen, Chatsworth, CA) y se marcaron con dUTP conjugado Spectrum-orange o Spectrum-green después de un protocolo de kit de traducción de muescas (Vysis, Downers Grove, IL). Después de lavar tres veces durante 5 min con PBS, las células se deshidrataron a través de una serie de etanol como anteriormente y se secaron al aire. El ADN se desnaturalizó durante 10 min a 70 ° C en tampón de hibridación que contenía formamida al 70% (Sigma) y soluciones 2 x SSC (pH 7,0). Después de la desnaturalización, las células se deshidrataron mediante una serie de etanol frío y se secaron al aire. Las células se sometieron a otros dos pasos de desnaturalización y deshidratación anteriores para eliminar completamente los anticuerpos fluorescentes γ-H2AX y 53BP1. Una mezcla de 100 ng de una sonda BAC conjugada con Spectrum-orange y una con Spectrum-green en un tampón de hibridación que contenía 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano y 1 × SSC se desnaturalizó a 78 ° C durante 5 min y luego se hibridó a las células durante 16 ha 37 ° C en una cámara humidificada. Los portaobjetos se lavaron durante 2 min con 0,4 x SSC / 0,3% NP-40 a 70ºC, y 1 min con 2 x SSC / 0,1% NP-40 a temperatura ambiente. Después de secarlas al aire, las células se tiñeron por contraste con DAPI. Los mismos núcleos identificados para la tinción de γH2AX / 53BP anteriormente se encontraron y capturaron automáticamente con conjuntos de filtros de paso único Spectrum-orange, Spectrum-green y DAPI utilizando el modo AutoCapt del sistema de software Metafer. Las imágenes se guardaron como 90 pilas z separadas por 0,2 µm. Los núcleos se analizaron mediante el sistema de análisis de imágenes digitales ISIS (MetaSystem). El mismo portaobjetos se volvió a analizar con un conjunto diferente de sondas BAC después de eliminar nuevamente las señales anteriores con los pasos de desnaturalización descritos anteriormente. Los sitios de mapeo físico de estos BAC se confirmaron usando análisis FISH regular de al menos 20 extensiones en metafase de células de fibroblastos normales por BAC, y no se observó polimorfismo.


Material complementario electrónico

13059_2007_1632_MOESM1_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 1: la secuencia del brazo p como se indica se adjuntó en la coordenada del brazo p, y el complemento inverso de las secuencias del brazo q se adjuntó en las coordenadas del brazo q indicadas (PDF 12 KB)

13059_2007_1632_MOESM2_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 2: Los módulos Duplicon se definieron procesando los resultados de las búsquedas BLAST de secuencias de consulta de subtelómeros seleccionadas internamente (ver texto y Materiales y métodos). Los pares colineales y correctamente orientados de coincidencias BLAST con la secuencia de consulta se unieron en una cadena si no estaban separados por más de 25 kb y no estaban interrumpidos por otros resultados de la misma secuencia de consulta. Los grupos de golpes de explosión encadenados que abarcan ≥1 kb de la secuencia objeto se definieron como duplicones. Estos métodos eran tolerantes a inserciones y deleciones & lt25 kb de tamaño (por ejemplo, de retrotransposones) pero no toleraban reordenamientos. (PDF de 61 KB)

13059_2007_1632_MOESM3_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 3: cada módulo se define mediante un conjunto de alineaciones por pares, y cada secuencia de referencia en estos conjuntos se representa como una sola fila en esta tabla. La primera columna (módulo) contiene un identificador para la copia particular del módulo (duplicón) indicado en las siguientes tres columnas. Estas columnas (secuencia de consulta) enumeran la ubicación subtelomérica de la secuencia de consulta que define el módulo (consulte Materiales y métodos). La columna 'secuencias alineadas' muestra las ubicaciones de otros duplicones en este módulo, emparejados por la consulta. Las coordenadas en esta columna se refieren a nuestros ensamblajes subteloméricos publicados (designados por cromosoma y brazo p o q) o al genoma humano construido 35 (todas las demás designaciones). La identificacióncada es el porcentaje de identidad de secuencia de nucleótidos a través del alineamiento por pares encadenado, excluyendo la secuencia enmascarada. La identificaciónpromedio es el porcentaje de identidad promedio de todas las alineaciones por pares en el módulo. Este fue el número utilizado para% ID en gráficos y análisis en este documento.La columna final muestra un 1 si el módulo contiene coincidencias de secuencias intracromosómicas no subteloméricas, y un 0 si no las contiene. (PDF de 772 KB)

13059_2007_1632_MOESM4_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 4: esta tabla muestra el número de módulos duplicones definidos por subtelómero. La lista completa de estos módulos se incluye en el archivo de datos adicional 3. La columna 'subtelomérica' muestra el número total de módulos para cada región de subtelómero (ya que cada módulo está definido por un conjunto de coordenadas subteloméricas). La columna 'no subtelomérica' enumera el subconjunto de estos módulos con homología con las regiones duplicadas que se encuentran fuera de los subtelómeros. Una comparación de estos duplicones no subteloméricos con las copias subteloméricas se incluye en la Figura 3 y en el archivo de datos adicional 5. La columna "intracromosómico" indica el subconjunto de módulos con homología a una región diferente en el mismo cromosoma. (PDF 27 KB)

13059_2007_1632_MOESM5_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 5: las regiones subteloméricas corresponden al conjunto de secuencias de consulta enumeradas en el archivo de datos adicional 1 y el porcentaje promedio de identidad en las secuencias a las que se alinea cada una. Las regiones no subteloméricas corresponden a las secuencias alineadas que quedan fuera de las regiones subteloméricas (el subconjunto enumerado en el archivo de datos adicional 2). (PDF 42 KB)

13059_2007_1632_MOESM6_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 6: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 846 KB)

13059_2007_1632_MOESM7_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 7: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 543 KB)

13059_2007_1632_MOESM8_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 8: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 531 KB)

13059_2007_1632_MOESM9_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 9: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 602 KB)

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Archivo de datos adicional 10: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 474 KB)

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Archivo de datos adicional 11: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 758 KB)

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Archivo de datos adicional 12: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 552 KB)

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Archivo de datos adicional 13: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 630 KB)

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Archivo de datos adicional 14: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el comienzo de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 564 KB)

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Archivo de datos adicional 15: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 793 KB)

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Archivo de datos adicional 16: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 657 KB)

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Archivo de datos adicional 17: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 654 KB)

13059_2007_1632_MOESM18_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 18: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el comienzo de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 693 KB)

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Archivo de datos adicional 19: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el comienzo de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 472 KB)

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Archivo de datos adicional 20: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 718 KB)

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Archivo de datos adicional 21: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 474 KB)

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Archivo de datos adicional 22: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el comienzo de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas del subtelómero). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 532 KB)

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Archivo de datos adicional 30: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF de 538 KB)

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Archivo de datos adicional 31: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 542 KB)

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Archivo de datos adicional 32: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 659 KB)

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Archivo de datos adicional 34: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 978 KB)

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Archivo de datos adicional 36: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 594 KB)

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Archivo de datos adicional 44: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 627 KB)

13059_2007_1632_MOESM45_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 45: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 508 KB)

13059_2007_1632_MOESM46_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 46: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 548 KB)

13059_2007_1632_MOESM47_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 47: Las secuencias de subtelómeros que se muestran son los ensamblajes publicados anteriormente [6] y están disponibles en el sitio web de Riethman Lab [47]. El extremo telomérico de cada conjunto de secuencia se encuentra a la izquierda. La distancia desde el final de la secuencia hasta el inicio de la matriz de repetición terminal se indica mediante la flecha vertical en el extremo telomérico de la secuencia. La posición y orientación de (TTAGGG) n tractos se muestran como flechas negras. Paneles superiores: los segmentos genómicos duplicados se identifican por cromosoma (color) y si son subteloméricos (rectángulos delimitados), no subteloméricos (rectángulos no delimitados) o intracromosómicos (ubicados sobre las coordenadas de los subtelómeros). Cada rectángulo representa un duplicón independiente. Paneles inferiores: los segmentos genómicos duplicados son los mismos que los de los paneles superiores, pero identificados por la similitud de la secuencia de nucleótidos con la secuencia del subtelómero de la consulta (esquema de color como se indica en la clave). (PDF 562 KB)

13059_2007_1632_MOESM48_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 48: esta tabla muestra bloques de módulos que ocurren exclusivamente en regiones de subtelómeros. La primera columna da un identificador para cada bloque. Las siguientes tres columnas (secuencia de consulta) dan la ubicación subtelomérica que define el bloque (que constará de uno o más módulos adyacentes). Para completar, en algunos casos se han incluido secuencias alineadas en estos bloques a pesar de que cayeron por debajo de los umbrales para la definición del módulo. Se indica el porcentaje de identidad de las alineaciones encadenadas entre las secuencias (excluyendo la secuencia enmascarada). Los genes / familias de genes con nombre que tienen transcripciones que coinciden con parte o todos los bloques de duplicones respectivos se enumeran en la última columna. El bloque 7 es la repetición en tándem D4Z4 en los subtelómeros 4q y 10q, para los que no se calcula ningún porcentaje de identidad debido al gran número y diversas identidades porcentuales de las alineaciones BLAST entre las repeticiones en tándem D4Z4. (PDF 22 KB)

13059_2007_1632_MOESM49_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 49: esta tabla muestra bloques de módulos adyacentes a los extremos de los telómeros terminados (consulte Materiales y métodos). Las columnas describen las mismas categorías de información que se indican en el archivo de datos adicional 48. Existe un conjunto limitado de copias no subteloméricas de duplicones subterminales (archivo de datos adicional 49). Sus ubicaciones genómicas sugieren sitios de reordenamientos cromosómicos ancestrales asociados a telómeros, incluida una fusión de telómeros bien documentada en 2q13-q14 [37] que contiene representantes de las familias de duplicones subterminal A, B, C y D (archivo de datos adicional 49). El sitio no subtelomérico de un duplicón de la familia D en 3p12.3 es la punta de una región de duplicación extendida, el ADN en el flanco centromérico de este sitio contiene homología de subtelómeros 4q y 10q, incluida la estructura de repetición satélite beta que se asemeja a parte de la repetición D4Z4 . La familia subterminal F contiene varios sitios no subteloméricos de duplicones, los de los cromosomas 22q, 14q y 12p están muy cerca de los respectivos centrómeros (archivo de datos adicional 49), lo que indica una posible inversión ancestral de un brazo cromosómico seguido de la duplicación de secuencias pericentroméricas como un mecanismo para la génesis de las copias no sub-terminales de esta familia de secuencias sub-terminales. La similitud de secuencia entre copias del duplicón subterminal dentro de una familia se encuentra principalmente en el rango del 90-96% para los bloques subterminales A, B y D (la Tabla 2, consulte el archivo de datos adicionales 49 para conocer las raras excepciones). Al igual que con los bloques de solo subtel, algunos de estos duplicones corresponden solo a una parte de la secuencia del bloque subterminal. También hay cierta superposición en las secuencias ocupadas por bloques de duplicón sub-terminal A, B y D, esto se refleja en su ocupación de partes de las mismas familias de transcripciones RPL23A7 y FAM41C (Tabla 2). Las homologías entre familias cruzadas entre los bloques subterminales A, B y D también están en el rango de identidad del 90-96%, pero las posiciones de los duplicones dentro de los bloques varían y están ubicadas a diferentes distancias del tracto (TTAGGG) n también, hay Hay varias organizaciones alternativas de elementos repetitivos de alta copia (enmascarados y no examinados en detalle en este estudio) dentro de estos bloques sub-terminales. Por lo tanto, podría haber una mezcla más frecuente de secuencias subterminales que secuencias ubicadas más centroméricamente, al menos dentro de un subconjunto de alelos subteloméricos. Esta idea es ampliamente consistente con un modelo anterior de estructura subtelomérica con compartimentos con propiedades funcionales distintas [9]. Un mayor refinamiento de la clasificación de estas familias sub-terminales parece factible y se beneficiará de un muestreo más extenso de (TTAGGG) secuencias n-adyacentes de alelos adicionales. El bloque subterminal F contiene un duplicón en 10p con una similitud muy alta con la secuencia de consulta 18p, lo que sugiere un evento de duplicación muy reciente, los duplicones restantes estaban todos en el intervalo de identidad del 91-94%. El bloque C tiene la mayor similitud de secuencia entre todas las familias de secuencias de duplicones subterminales y tiene una copia en el locus de fusión 2q. El bloque E (96-97%) es inusual porque corresponde a una porción de la familia 6 de duplicones solo subteloméricos (Tabla 1), y es la única familia de secuencias de duplicones subterminal con propiedades solo subteloméricas. Este alelo secuenciado particular de 17p podría haberse formado por el truncamiento de un extremo cromosómico dentro de este gran duplicón solo de subtélómero, ya que existe evidencia cartográfica de varios alelos más largos del telómero 17p (H Riethman, no publicado). Es interesante observar que (TTAGGG) n tractos en 17p y, de hecho, en este alelo particular de 17p tienden a estar constantemente entre los más cortos del genoma humano [19, 51]. (PDF 44 KB)

13059_2007_1632_MOESM50_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 50: Comparación de los bloques de duplicón subtelomérico y subterminal definidos en este trabajo con los bloques de homología subtelomérica informados en Linardopoulou et al. [12] (PDF 17 KB)

13059_2007_1632_MOESM51_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 51: las transcripciones candidatas se identificaron mediante la explosión de las secuencias representativas de consulta de subtélómeros únicamente (archivo de datos adicional 48) contra la base de datos NCBI RefSeq mrna (descargado el 24 de julio de 2006) [52]. Se ejecutaron ARNm humanos con homología del 90% o más a través de Spidey [53] contra el conjunto de representantes de bloque de duplicón solo de subtélómeros. Esta tabla ha sido filtrada para aquellos aciertos por encima del 95% de identidad de acuerdo con las predicciones de Spidey. La primera y la segunda columnas indican el bloque de solo subtelómero y la accesión de RefSeq que se alinean entre sí. La tercera es la línea de descripción de la base de datos RefSeq. Las columnas cuarta y quinta son el porcentaje de identidad y el porcentaje de cobertura del ARNm alineado según lo informado por Spidey. (PDF 29 KB)

13059_2007_1632_MOESM52_ESM.pdf

Archivo de datos adicional 52: las transcripciones candidatas se identificaron mediante la explosión de las secuencias representativas de consulta subterminal (archivo de datos adicional 49) contra la base de datos NCBI RefSeq mrna (descargado el 24 de julio de 2006) [52]. Se ejecutaron ARNm humanos con homología del 90% o más a través de Spidey [53] contra el conjunto de representantes del bloque de duplicón subterminal. La primera y la segunda columnas indican el bloque subterminal y la accesión RefSeq que se alinean entre sí. La tercera es la línea de descripción de la base de datos RefSeq. Las columnas cuarta y quinta son el porcentaje de identidad y el porcentaje de cobertura del ARNm alineado según lo informado por Spidey. (PDF 72 KB)


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